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背景:刀豆蛋白A(Con A)诱导的小鼠肝炎模型是一种成熟的模拟人类自身免疫性肝病的小鼠模型。目前认为,CD4+T细胞在这种小鼠肝病模型中发挥最主要的致病性作用,同时NK细胞、NKT细胞、γδT细胞、Treg细胞等细胞也可通过细胞杀伤作用、分泌细胞因子参与疾病过程。此前有研究显示,在Con A诱导的小鼠肝炎模型中,颗粒酶(Perforin)可明显加重肝炎病理表现,但Perforin的主要来源尚且不明,而对于CD8~+T细胞在Con A诱导的肝炎中的作用目前鲜有文献报道,机制不明。在本实验室前期研究发现,损害相关模式分子(DAMPs)高迁移率族蛋白1(HMGB1)和白细胞介素-33(IL-33)作为内源性的炎症警报素,在Con A诱导的小鼠肝炎中发挥重要作用。其中IL-33由受损伤的肝细胞产生,可促进肝炎的病理过程和二型固有淋巴细胞的免疫反应。我们推测CD8~+T细胞被Con A激活后,通过Perforin的细胞杀伤作用对肝细胞造成病理性损伤,损伤的肝细胞产生IL-33,进而通过IL-33/ILC2s途径参与Con A诱导的肝炎的发生发展。目的:研究CD8~+T细胞是否能通过肝细胞/IL-33/ILC2s途径参与小鼠Con A诱导的自身免疫性肝炎的发病过程,并阐明其机制。方法:1.野生型C57BL/6小鼠和Rag2 KO小鼠构建Con A诱导的小鼠急性肝炎:(1)C57BL/6小鼠经尾静脉注射Con A(15mg/kg),注射后第10小时处死小鼠,同时收集实验所需组织样本;(2)Rag2缺失的小鼠(Rag2-/-)经尾静脉单独或联合过继转移CD4+T细胞、NKT细胞、γδT细胞或CD8~+T细胞,1小时后注射Con A,10小时后处死小鼠并收集实验所需组织样本;2.小鼠原代肝细胞体外培养以及与淋巴细胞混合培养:小鼠处死后用两步法取原代肝细胞并在体外培养3天后,与淋巴结来源的淋巴细胞混合培养。培养1小时后加Con A或IL-33进行刺激;3.小鼠肝脏组织HE染色、TUNEL染色以及血清ALT检测,评估小鼠肝脏的病理学改变;4.免疫荧光技术检测小鼠肝脏样本以及体外培养肝细胞的IL-33、Perforin以及PI/Annexin V的水平;5.流式细胞术(FACS)检测小鼠肝脏中单个核细胞(hepatic mononuclear cells,HMCs)和体外培养的淋巴结淋巴细胞中NKT细胞、γδT细胞和ILC2细胞的数量及各种细胞分泌的相关细胞因子的水平;6.组织、血清及细胞培养上清,应用ELISA技术检测实验相关细胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ以及IL-33的水平;7.Real-Time PCR技术检测小鼠肝脏组织和肝内单个核细胞IL-33的m RNA的表达水平;8.磁珠分选技术分离NKT细胞、γδT细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8~+T淋巴细胞,以进行细胞过继转移实验或细胞体外培养;9.流式细胞分选技术对ST2~+ILC2细胞进行分选,研究ST2~+ILC2细胞在ConA诱导的小鼠急性肝损伤中的作用。结果:1.小鼠血清ALT水平检测和肝脏大体标本观察及组织病理学结果显示,Con A诱导的小鼠急性肝炎模型建立成功;2.活化的CD8~+T细胞在Con A刺激野生型C57BL/6小鼠的肝脏中数量显著升高;3.Rag2基因缺失小鼠单独过继转移或联合过继转移CD4+T细胞、NKT细胞或γδT细胞,经Con A刺激后血清酶学指标和肝脏大体样本病理学检测均未见明显病理学改变;联合过继转移CD4+T细胞和CD8~+T细胞,并经尾静脉注射Con A 10小时后,可检测到明显肝组织损伤,血清中ALT水平显著升高;4.在两种基因背景(C57BL/6和Rag2-/-)建立肝炎模型的小鼠中,血清IL-33水平均显著升高,同时ST2~+ILC2细胞数量相应增多;5.在体实验和体外实验中,ST2~+ILC2细胞相关细胞因子IL-5和IL-13的表达水平显著升高,且肝脏中嗜酸性粒细胞数量明显增多;6.过继转移ST2~+ILC2细胞的野生型C57BL/6小鼠,经Con A处理后,肝细胞损害程度较对照组明显加重,且CD4+T细胞相关细胞因子IL-4和IL-5分泌量较对照组显著升高。结论:在Con A诱导的小鼠急性肝炎发病过程中,CD8~+T细胞通过Perforin的作用对小鼠肝细胞造成损伤,而受损的肝细胞释放IL-33。ST2~+ILC2细胞在IL-33的作用下增殖并活化,相关细胞因子IL-5和IL-13的分泌量显著升高,募集中性粒细胞到肝脏部位。同时CD4+T细胞相关细胞因子IL-4和IL-5分泌量增高。从而加重Con A诱导的小鼠急性肝炎的肝脏损伤。这一发现可以帮助进一步探讨自身免疫性肝炎的发病机制。