论文部分内容阅读
目的:通过建立羊痒病因子22L感染BALB/c小鼠的模型,探讨朊蛋白病发病的分子机制,寻找朊蛋白病新的分子标记物。方法:利用朊蛋白病中羊痒病来源的22L毒株,通过脑内接种的方法建立羊痒病因子22L感染BALB/c小鼠的模型,通过观察小鼠临床症状确定生存期;通过HE染色观察脑组织的病理变化;Western blotting和免疫组织化学染色观察胶质细胞增生和PrPsc聚集的情况;通过全基因表达谱芯片和miRNA芯片技术分别检测22L感染BALB/c小鼠小脑在接毒后60、90、120和145天（终末期）全基因表达谱以及接毒后145天小脑的miRNA表达谱,经生物信息学分析后,挑选分子作real time PCR验证;通过LC-MS/MS和MALDI-TOF IMS观察终末期小鼠全脑蛋白质组的变化和多肽的表达变化,挑选分子作Western blotting验证。结果:22L感染BALB/c小鼠的平均生存期为142.6±5.0天;实验组脑组织出现不同程度的空泡、胶质细胞增生以及PrPsc的聚集,以小脑最为严重。基因芯片在60 dpi,369个基因下调,322个基因上调;在90 dpi,127个基因下调,337个基因上调;120 dpi,633个基因下调,557个基因上调;145 dpi（终末期）,有384个基因下调,346个基因上调。经生物信息学分析,发现在接毒后120天和145天差异表达基因的主要功能表现为炎症反应。定量PCR检测显示,除TLR4以外,实验组小脑IL-1β、TNFа、TGFβ1、CCL4、CCL5和TLR1-13的mRNA水平均高于对照组,并且在病程终末期最为明显。其中,实验组TGFβ1、TNFа、TLR1、TLR2、TLR5、TLR7、TLR 8和TLR9的mRNA水平随着病程的进展呈时间依赖性升高,且均在120 dpi时开始出现显著性升高。Western blotting证实了实验组TLR7、TLR9在终末期明显高于对照组。在病程终末期,经Real time PCR证实小脑miRNA-448和miRNA-142-3P明显升高。蛋白组学分析显示,实验组与对照组相比有137个具有统计学意义的差异蛋白,其中108个蛋白上调,29个蛋白下调。26个蛋白上调≥2倍,10个蛋白下调≥2倍。经Western blotting验证,Hsp60、Calreticulin蛋白下调,Alpha-internaxin、Contactin 1、Cofilin 1、Neurofascin表达上调。MALDI-TOF IMS分析结果显示,实验组脑组织有22个多肽表达降低,其中,m/z 758.7725和m/z 5432.2069下降最明显。结论:本研究成功建立羊痒病22L感染BALB/c小鼠的模型,该模型具有朊蛋白病特有的病理学特征,其中小脑是其病理损伤最严重的部位。PrPsc在CNS的聚集可能通过刺激胶质细胞增生,从而产生大量的前炎症因子和趋化因子,导致炎症的发生和TLRs表达的升高。22L感染BALB/c小鼠miR-448和miR- 142-3P表达升高,提示这两个分子在朊蛋白病发病中可能起调控作用。22L感染BALB/c小鼠可能通过上调Alpha-internexin,导致神经退行性变的发生, Alpha-internexin可能是朊蛋白病的新的分子标记物,对朊蛋白病的诊断有重要意义。22L感染使Hsp60和Calreticulin表达下降,导致异常折叠的蛋白不能被及时清除并在CNS聚集。Hsp60和Calreticulin可能作为朊蛋白病的新的治疗靶点。多肽m/z 758.7725和m/z 5432.2069在22L感染的模型鼠表达明显下降,提示这2个多肽可能是朊蛋白病的新的分子标记物,对朊蛋白病的诊断有重要意义。