肺动脉高压(PAH)是以肺动脉压力升高以及血管痉挛、内膜增生和重构为主要特征的一种疾病。其发病机制尚未完全明确,目前观点认为,肺动脉高压形成的关键在于肺血管收缩和重构。肺动脉高压时,肺血管发生重构主要是由于血管平滑肌细胞增殖凋亡失衡引起的,因此抑制肺血管收缩,改善肺循环血流动力学以及阻止肺血管平滑肌细胞异常增殖是治疗肺动脉高压的关键。钙信号转导在肺动脉高压发生发展过程中起着非常重要的作用,细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化是触发细胞增殖相关信号转导的始动因素之一。在PAH发生过程中,5-HT等细胞因子激动相应的细胞表面受体后,都要通过胞质内游离钙浓度增高这一信号转导途径发挥作用,因此,[Ca2+]i的变化在PAH的形成过程中具有重要作用。钙拮抗剂是近年来临床常用的抗肺动脉高压药物,但关于其逆转肺动脉高压的确切机制尚不甚明了。间尼索地平(m-Nis)是我校药学院合成的二氢吡啶类钙拮抗剂,前期研究表明其具有良好的稳定性以及抑制血管收缩的作用。本实验以野百合碱(MCT)诱导的大鼠肺动脉高压为模型,观察m-Nis对肺动脉高压的防治作用及肺血管重构的改善作用。还通过细胞免疫化学、流式细胞术、激光共聚焦及细胞分子生物学等技术研究m-Nis对5-HT诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移的影响,深入探讨其作用机制。第一部分m-Nis对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的防治作用目的:研究m-Nis对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的防治作用及其作用机制。方法:大鼠单剂量皮下注射MCT(60mg/kg)制备肺动脉高压模型。导管法测定肺血流动力学指标。光镜观察肺小动脉结构的改变。按试剂盒步骤测定血清中MDA含量及SOD活性。免疫印迹法测定PCNA、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平。免疫组化法观察5-HT和PCNA的表达。结果:1 m-Nis对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠平均肺动脉压(PAP)及其它血流动力学指标的影响模型组PAP(17.4±1.6 mmHg)比对照组(10.5±1.6 mmHg)显著升高(P<0.01);与模型组相比,m-Nis 0.5, 1.0和2.0 mg/kg组的PAP分别降至14.4±1.1,14.0±1.3及13.6±0.9mmHg(P<0.01)。而平均颈动脉压(SAP)及心率在各组之间并无显著差异。2 m-Nis对肺动脉高压大鼠右室肥厚的影响与对照组相比,模型组大鼠体重显著降低(P<0.05),右心室重量/体重(RV/BW)明显升高(从0.79±0.09升至1.05±0.09,P<0.01),m-Nis 0.5, 1.0和2.0mg/kg对大鼠体重并无改善作用,却使RV/BW分别降至0.90±0.04,0.83±0.07,0.85±0.09(P<0.05或P<0.01,与模型组相比)。RV/(LV+SP)测定结果表明:与对照组相比,模型组大鼠RV/(LV+SP)明显升高(从0.307±0.007升至0.408±0.015,P<0.01),而m-Nis 0.5, 1.0, 2.0mg/kg组的RV/(LV+SP)分别降至0.365±0.013, 0.341±0.023和0.353±0.021(P<0.01,与模型组相比)。3 m-Nis对肺动脉高压大鼠肺小动脉构型改变的影响光镜下观察HE染色切片,发现模型组肺小动脉中膜厚度增加,血管管腔狭窄甚至闭塞。与对照组相比,MT%显著增加(P<0.01),VA%明显减少(P<0.01),而m-Nis各组均不同程度地减轻肺组织损伤程度,肺小动脉中膜增厚程度也有明显减轻,与模型组相比, MT%明显降低(P < 0.05或P < 0.01),而VA%明显增加(P < 0.01)。4 m-Nis对肺动脉高压大鼠血清中SOD活性及MDA含量的影响与对照组相比,模型组大鼠血清中MDA含量显著升高(从6.32±0.27升至7.62±0.63nmol/ml,P<0.01),SOD活性明显降低(从163±10降至122±11 U/ml,P < 0.01)。而m-Nis 0.5,1.0,2.0mg/kg组均不同程度地逆转了上述反应,MDA含量分别降至6.49±0.82,6.76±0.38及6.40±0.60(P< 0.05),SOD活性相应升至142±12(P<0.05),149±8和146±11(P<0.01)。5 m-Nis对肺动脉高压大鼠肺组织中5-HT表达的影响与对照组相比,模型组大鼠肺组织中5-HT阳性细胞百分率显著增加(从4.2±2.1%增至14.2±3.0%,P<0.01)。m-Nis 0.5,1.0,2.0mg/kg组5-HT阳性细胞百分率分别降至8.6±1.3%,7.1±1.9%和7.2±1.0%(P<0.01,与模型组相比)。6 m-Nis对细胞增殖核抗原(PCNA)表达的影响PCNA免疫组化染色结果表明,与对照组相比,模型组大鼠肺组织中PCNA阳性细胞百分数显著增加(P<0.01),胞核染色较深。而m-Nis各组PCNA阳性细胞百分数均明显减少,与模型组相比有明显差异(P<0.01)。western blot结果分析表明,与对照组相比,模型组大鼠肺动脉中PCNA蛋白表达显著增加(P<0.01),而m-Nis 0.5,1.0和2.0mg/kg组PCNA蛋白表达水平明显降低(P <0.05,与模型组相比)。7 m-Nis对ERK1/2磷酸化水平的影响western blot结果表明,与对照组相比,模型组大鼠肺动脉中p-ERK1/2蛋白表达显著增加(P<0.01),各浓度m-Nis均能明显抑制其表达(P<0.01)。而总ERK1/2的表达水平在各组之间并无显著性差异。各组条带灰度值计算结果表明,模型组p-ERK1/2/ ERK1/2的比值明显增加(P<0.01,与对照组相比),而m-Nis可明显降低此比值(P<0.05,与模型组相比)。结论:m-Nis能明显降低肺动脉高压大鼠的平均肺动脉压,改善右室肥厚程度及肺小动脉构型改变,对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压有一定的防治作用,可能与其抗氧化作用,降低5-HT的表达及抑制ERK1/2 MAPK信号通路有关。第二部分m-Nis对5-HT诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移及细胞内游离钙浓度变化的影响目的:研究m-Nis对5-HT诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移及细胞内游离钙浓度变化的影响方法:组织块种植法原代培养大鼠PASMCs。MTT法测定PASMCs增殖。Transwell迁移小室(8μm孔径)测定PASMCs的迁移能力。流式细胞仪测定细胞周期。免疫细胞化学染色及western blot法测定PCNA蛋白表达。激光共聚焦显微镜检测平滑肌细胞内Ca2+的变化。定磷法测定CaN活性。western blot法测定ERK1/2及JNK的磷酸化水平。RT-PCR法检测c-fos、c-jun、CaM及CaN mRNA的表达。结果:1 m-Nis平对5-HT诱导的PASMCs增殖的影响MTT结果表明,与对照组比,5-HT组A值明显升高(从0.48±0.04升至0.74±0.09,P <0.01)。与5-HT组比,m-Nis 10-5,10-6,10-7,10-8 mol/L组A值分别下降至0.54±0.05,0.57±0.07,0.59±0.06(P <0.01),0.62±0.07 (P <0.05)。western blot结果显示,与对照组相比,5-HT组PASMCs的PCNA表达明显增加(P<0.01)。不同浓度m-Nis预处理,均明显降低5-HT诱导的PCNA的表达(P<0.05或P<0.01)。PCNA免疫细胞化学染色结果表明,5-HT处理组PCNA阳性细胞百分率明显高于对照组(P<0.01)。不同浓度m-Nis预处理后,均明显降低5-HT诱导的PCNA的阳性表达(P<0.01)。2 m-Nis对5-HT诱导的PASMCs细胞迁移的影响与对照组比,5-HT(1μmol/L)能明显促进PASMCs迁移,平均每个视野下的迁移细胞数从对照组的34±7增加至95±13(P<0.01)。与5-HT组比,m-Nis 10-5,10-6,10-7,10-8 mol/L组平均每个视野下的迁移细胞数分别下降至43±9,44±10,58±9,62±9(P <0.01)。3 m-Nis对PASMCs细胞周期的影响与对照组比,5-HT组G0/G1期PASMCs百分率明显减少(从84%降至55%,P < 0.01),S期PASMCs百分率明显增加(从4%增至21%,P < 0.01),PI值也相应增加(从16%增至45%,P <0.01),提示5-HT能诱导PASMCs增殖。与5-HT组比,m-Nis 10-5,10-6,10-7 mol/L组G0/ G1期PASMCs百分率分别增至78%(P < 0.01),71%和64%(P < 0.05),S期PASMCs百分率也分别降至6%,10%和11%(P < 0.05或P < 0.01),G2/M期细胞无显著变化,说明m-Nis作用后使细胞停滞于G0/G1期。PI值分别降至22%,29%和36%(P <0.05或P <0.01)。而m-Nis 10-8 mol/L对细胞周期及PI值均无明显影响。4 5-HT对培养的大鼠PASMCs内游离钙离子浓度的影响Flou-3/AM负载的肺动脉平滑肌细胞图象清晰,可较好地显示细胞内游离钙离子浓度的变化过程,在加入1μmol/L 5-HT后,荧光强度增强,表明细胞内钙离子浓度迅速升高,在90s左右达到峰值,然后减弱,在200s左右荧光强度达到稳定的状态,而后有一个较长的平台期。5 m-Nis对5-HT诱导大鼠PASMCs内[Ca2+]i升高的影响在5-HT组,达峰值时其相对荧光强度(FI-F0)/F0为132.4±4.3%,与对照组相比明显升高(P<0.01)。与5-HT组相比,m-Nis 10-5,10-6,10-7,10-8 mol/L均能明显抑制5-HT诱导的细胞内钙离子浓度的升高,达峰值时相对荧光强度(FI-F0)/F0分别为20.1±4.1%,33.6±9.0%,41.5±2.3%和54.7±2.2%(P<0.01)。6 m-Nis对5-HT诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞CaN活性的影响与对照组相比,5-HT组CaN活性明显升高(从1.7±0.5升至3.7±0.8μmol Pi/mg pro/h,P < 0. 01),m-Nis 10-5, 10-6,10-7,10-8mol/L均不同程度地降低了5-HT诱导的PASMCs中CaN活性的升高(分别降至2.4±0.6,2.9±0.6,3.0±0.7和3.1±0.5,P< 0. 05或P<0.01)。7 m-Nis对5-HT诱导大鼠PASMCs内CaM、CaN mRNA表达的影响与对照组相比,1μmol/L 5-HT作用24小时后明显诱导大鼠PASMCs内CaM及CaN mRNA表达水平升高(P < 0.01),加入m-Nis 10-5,10-6,10-7 mol/L预处理均明显抑制了5-HT诱导的CaM mRNA表达水平的升高(P < 0.05或P < 0.01),而m-Nis 10-8 mol/L抑制作用不明显。m-Nis 10-5,10-6,10-7,10-8 mol/L均明显抑制了5-HT诱导的CaN mRNA表达水平的升高(P < 0.05或P < 0.01)。8 m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs中ERK1/2及JNK磷酸化的影响western blot结果显示,1μmol/L 5-HT在5至30分钟内诱导大鼠动脉平滑肌细胞ERK1/2及JNK磷酸化水平明显升高,在15分钟时磷酸化水平最高。而m-Nis可浓度依赖性地拮抗5-HT的作用。m-Nis 10-5,10-6,10-7 mol/L可明显抑制5-HT诱导的ERK1/2磷酸化水平的升高(P < 0.05或P < 0.01),而m-Nis 10-8 mol/L的抑制作用并不明显。10-8 ~10-5 mol/L m-Nis均可抑制5-HT诱导的JNK磷酸化水平的升高(P < 0.05或P < 0.01)。9 m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs中c-fos及c-jun mRNA表达的影响1μmol/L 5-HT在5至60分钟内能明显诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞c-fos及c-jun mRNA表达水平升高,在30分钟时表达水平达最高。而不同浓度m-Nis均明显抑制了5-HT诱导的c-fos及c-jun mRNA表达水平的升高(P < 0.05或P < 0.01)。结论:(1)m-Nis对5-HT诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移有明显的抑制作用,可能与其抑制增殖细胞核抗原(PCNA)表达及细胞周期进程有关。(2)m-Nis明显抑制了5-HT引起的[Ca2+]i的升高、CaM和CaNmRNA的表达以及CaN活性的升高;对5-HT诱导的ERK1/2, JNK磷酸化水平也有不同程度的抑制,还明显抑制了增殖相关基因c-fos, c-jun mRNA的表达水平。由此,我们推测m-Nis抗5-HT诱导的PASMCs增殖作用可能还与抑制细胞内[Ca2+]i的增高从而阻断了5-HT所介导的ERK1/2, JNK MAPK信号通路有关。第三部分RhoA/Rho激酶信号通路在5-HT刺激PASMCs增殖中的作用及m-Nis对此信号通路的影响目的:研究RhoA/Rho激酶信号通路在5-HT刺激PASMCs增殖中的作用及m-Nis对此信号通路的抑制作用。方法:组织块种植法原代培养大鼠PASMCs。MTT法测定PASMCs增殖。流式细胞仪测定细胞周期。western blot法测定PCNA蛋白表达及ERK1/2、JNK、MYPT1磷酸化水平。RT-PCR法检测RhoA、ROCK1、c-fos及c-jun mRNA的表达。结果:1法舒地尔对5-HT诱导的PASMCs增殖的影响MTT实验结果表明,与对照组比,5-HT组A值明显升高(从0.37±0.05升至0.61±0.03,P <0.01)。法舒地尔25、50、100μmol/L各组A值分别降至0.48±0.05,0.46±0.03和0.43±0.04(P <0.01)。western blot结果显示,与对照组比,5-HT组PCNA蛋白表达明显增多(P <0.01),而25、50、100μmol/L法舒地尔不同程度地降低了PCNA的蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。2法舒地尔对5-HT作用下PASMCs细胞周期的影响与对照组比,5-HT组G0/G1期PASMCs百分率明显减少(从83%降至55%,P < 0.01), S期PASMCs百分率明显增加(从4%增至21%,P < 0.01),PI值也相应增加(从17%增至45%,P <0.01),提示5-HT能诱导PASMCs增殖。与5-HT组比,法舒地尔25,50,100μmol/L组G0/ G1期PASMCs百分率分别增至65%,70%和78%(P<0.05或P<0.01),S期PASMCs百分率也分别降至12%,11%和9%(P < 0.05或P < 0.01),PI值分别降至35%,30%和22%(P <0.05或P <0.01)。3法舒地尔对5-HT诱导的ROCK激活的影响与对照组比,1μmol/L 5-HT明显诱导了ROCK1 mRNA的表达(P < 0.01),法舒地尔25、50、100μmol/L预处理不同程度地降低了5-HT诱导的ROCK1 mRNA的表达(P < 0.05或P < 0.01)。western blot结果显示,1μmol/L 5-HT作用后明显升高了MYPT1的磷酸化水平,10分钟左右磷酸化水平最高(P < 0.01),法舒地尔25、50、100μmol/L不同程度地降低了5-HT诱导的MYPT1的磷酸化水平(P < 0.05或P < 0.01)。4法舒地尔对5-HT作用下ERK1/2及JNK磷酸化水平的影响与对照组比,5-HT作用15分钟明显诱导了ERK1/2的磷酸化(P<0.01),法舒地尔25、50、100μmol/L预处理对ERK1/2的磷酸化水平没有明显影响。而对于JNK的磷酸化水平,5-HT作用15分钟能明显诱导其升高(P < 0.01),法舒地尔25、50、100μmol/L预处理明显降低了JNK的磷酸化水平(P < 0.01)。另外,5-HT明显增加了核蛋白中p-ERK1/2的表达,15分钟左右表达水平最高(P <0.01),法舒地尔25、50、100μmol/L预处理明显降低了核蛋白中p-ERK1/2的表达(P < 0.01)。5法舒地尔对5-HT作用下c-fos和c-jun mRNA表达的影响与对照组比,5-HT作用30分钟明显诱导了c-fos及c-jun mRNA表达(P < 0.01)。法舒地尔25、50、100μmol/L预处理均明显抑制了5-HT诱导的c-fos (P < 0.01)及c-jun mRNA的表达(P < 0.05或P < 0.01)。6 m-Nis对5-HT作用下PASMCs中RhoA/ROCK通路的影响与对照组比,5-HT明显诱导了RhoA、ROCK1 mRNA的表达(P < 0.01),m-Nis10-5 mol/L明显降低5-HT诱导的RhoA mRNA的表达(P < 0.05)。m-Nis 10-5,10-6 mol/L还不同程度地降低了5-HT诱导的ROCK1 mRNA的表达(P < 0.05或P < 0.01)。western blot结果显示,5-HT作用10分钟明显升高了MYPT1的磷酸化水平(P < 0.01),m-Nis 10-5,10-6,10-7 mol/L预处理不同程度地降低了5-HT诱导的MYPT1的磷酸化水平(P < 0.05或P < 0.01),而m-Nis 10-8 mol/L对MYPT1的磷酸化水平无明显影响。结论:(1)5-HT明显诱导了大鼠PASMCs中Rho激酶的表达及激活;Rho激酶抑制剂法舒地尔对5-HT诱导的PASMCs的增殖,细胞周期进展有明显的抑制作用,还不同程度地抑制了JNK的磷酸化,ERK1/2的核转位以及增殖相关基因c-fos、c-jun mRNA的表达。说明RhoA/ROCK通路在5-HT诱导的PASMCs增殖中起着重要作用。(2)m-Nis不同程度地抑制了5-HT诱导的RhoA, ROCK1 mRNA的表达以及Rho激酶的活化标志p-MYPT1的蛋白表达。说明m-Nis抗5-HT诱导的PASMCs的增殖作用可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。第四部分活性氧在5-HT刺激PASMCs增殖中的作用及m-Nis对此通路的影响目的:研究活性氧(ROS)在5-HT刺激PASMCs增殖中的作用和m-Nis对ROS的产生及其下游信号通路的影响。方法:组织块种植法原代培养大鼠PASMCs。激光共聚焦检测ROS生成量的变化。TAB法测定MDA含量。黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。MTT法测定PASMCs增殖。western blot法测定PCNA蛋白表达及ERK1/2、JNK磷酸化水平。结果:1 m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs内ROS生成的影响1μmol/L的5-HT处理不同时间组,荧光强度均增强,5-HT处理15分钟组荧光强度最强,达对照组的288±54%(P<0.01),然后减弱,在5-HT处理120和240分钟组荧光强度达到稳定的状态,但仍明显高于对照组(P<0.01)。m-Nis 10-5,10-6,10-7,10-8mol/L均能明显抑制5-HT诱导的ROS的生成,在5-HT处理15分钟时荧光强度分别降为对照组的157±29%,173±38%,178±43%和215±45%(P<0.01)。2 m-Nis对5-HT作用下大鼠PASMCs内SOD活性和MDA含量的影响与对照组相比,5-HT处理组SOD活性明显降低(P < 0. 01),MDA含量明显升高(P < 0. 01)。m-Nis 10-5,10-6,10-7mol/L预处理均不同程度地逆转了5-HT诱导的PASMCs SOD活性的降低(P < 0. 05或P < 0. 01),同时也降低了MDA的含量(P < 0. 05或P < 0. 01),而m-Nis 10-8mol/L对SOD的活性没有明显影响,但可降低MDA的含量(P < 0.05)。3 m-Nis平对H2O2诱导的大鼠PASMCs增殖的影响MTT实验结果表明,100μmol/L H2O2能明显促进大鼠PASMCs增殖,与对照组比,H2O2处理组A值明显提高(P <0.01)。与H2O2处理组比,m-Nis各组A值均不同程度降低(P <0.05或P <0.01)。western blot结果显示,与对照组相比,H2O2处理组PASMCs的PCNA表达明显增加(P<0.01)。不同浓度m-Nis预处理后,均明显降低H2O2诱导的PCNA的表达(P<0.05或P<0.01)。4 m-Nis对H2O2诱导的PASMCs中ERK1/2及JNK磷酸化水平的影响与对照组相比,100μmol/L H2O2作用15分钟时能明显升高大鼠脉平滑肌细胞ERK1/2及JNK磷酸化水平(P<0.01)。m-Nis 10-5,10-6,10-7 mol/L可明显抑制H2O2诱导的ERK1/2及JNK磷酸化水平的升高(P < 0.05或P < 0.01),而m-Nis 10-8mol/L仅明显抑制了ERK1/2磷酸化水平的升高(P < 0.05),对JNK磷酸化水平无明显影响。结论:(1)5-HT明显诱导了大鼠PASMCs中ROS的生成,H2O2不仅诱导了PASMCs增殖,还提高了ERK1/2及JNK的磷酸化水平。说明ROS在5-HT诱导的PASMCs增殖中起重要作用。(2)m-Nis不仅抑制了ROS的生成,还明显降低了H2O2诱导的PASMCs增殖及ERK1/2、JNK的磷酸化水平。说明m-Nis抗5-HT诱导的PASMCs增殖作用不仅与其抑制ROS的产生有关,还与其抑制ROS所介导的ERK1/2,JNK MAPK信号通路有关。总结1 m-Nis对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压有一定的防治作用,可能与其抗氧化作用,降低5-HT的表达及抑制ERK1/2 MAPK信号通路有关。2 m-Nis对5-HT诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移有明显的抑制作用,可能与其抑制细胞内[Ca2+]i的增高从而阻断了5-HT所介导的ERK1/2,JNK MAPK信号通路有关。3 Rho激酶抑制剂法舒地尔明显抑制了5-HT诱导的PASMCs增殖,说明RhoA/ROCK通路在5-HT诱导的PASMCs增殖中起重要作用。4 m-Nis不同程度地抑制了5-HT诱导的RhoA, ROCK1 mRNA的表达以及Rho激酶的活化标志p-MYPT1的蛋白表达。说明m-Nis抗5-HT诱导的PASMCs的增殖作用可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。5 ROS在5-HT诱导的PASMCs增殖中起重要作用。m-Nis抗5-HT诱导的PASMCs增殖作用不仅与其抑制ROS的产生有关,还与其抑制ROS所介导的ERK1/2,JNK MAPK信号通路有关。