【摘 要】
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DNA甲基化是重要的表观遗传过程之一,参与许多基本的生物过程,包括细胞增殖,基因组印记和所有真核细胞和原核细胞中的基因转录。异常甲基化被证明与许多人类疾病密切相关,包括系统性红斑狼疮,霍奇金淋巴瘤,白血病,甚至致命的癌症。因此,异常的甲基化被认为是癌症标志物,对甲基化酶及其抑制剂的高灵敏度和准确评估在临床诊断和表观遗传治疗中尤为重要。传统的单级信号扩增方法通常难以满足痕量目标物的检测,亟需构建一种
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DNA甲基化是重要的表观遗传过程之一,参与许多基本的生物过程,包括细胞增殖,基因组印记和所有真核细胞和原核细胞中的基因转录。异常甲基化被证明与许多人类疾病密切相关,包括系统性红斑狼疮,霍奇金淋巴瘤,白血病,甚至致命的癌症。因此,异常的甲基化被认为是癌症标志物,对甲基化酶及其抑制剂的高灵敏度和准确评估在临床诊断和表观遗传治疗中尤为重要。传统的单级信号扩增方法通常难以满足痕量目标物的检测,亟需构建一种多级、高灵敏检测甲基化酶的信号扩增技术。本论文已成功构建了两种基于荧光共振能量转移（FRET）的恒温信号扩增方法用于灵敏地检测甲基化酶,具体如下:（1）基于非酶、恒温的催化发夹自组装-杂交链式反应（CHA-HCR）用于放大检测甲基化酶以及筛选甲基化酶抑制剂。首先,合理设计茎端含有M.Sss I甲基化酶或Hpa II剪切酶识别位点的辅助发夹HM,其能被Hpa II特异性剪切并释放出引物以引发CHA-HCR介导的荧光共振能量转移（FRET）信号产生。然而,M.Sss I甲基化的底物HM不能被Hpa II剪切,因此CHA-HCR反应不能发生且不产生FRET信号。作为恒温均相感应策略,该CHA-HCR体系能够选择性和超灵敏检测M.Sss I,检测限低至1.2×10-4U/m L。该体系能筛选甲基化酶抑制剂,这对于未来的临床诊断和新药设计具有重要意义。该体系具有通用性,并能通过只改变辅助发夹底物的特定序列来检测其他分析物,例如Dam甲基化酶。该检测体系可在复杂的生物样品（包括血清和大肠杆菌）中对甲基化酶进行超灵敏检测,为癌症治疗和生物医学研究带来巨大希望。（2）基于杂交链式反应-脱氧核酶（HCR-DNAzyme）的荧光法,构建了多重信号扩增的甲基化酶检测方法。巧妙设计的发夹底物作为甲基化酶和剪切酶的底物,同时其包含引发HCR-DNAzyme的引物序列。无M.Sss I甲基化酶时,底物被Hpa II剪切酶剪切,释放的引物链引发HCR-DNAzyme反应;存在M.Sss I时,剪切酶不能剪切甲基化的底物链,HCR-DNAzyme反应不能发生。荧光强度随M.Sss I浓度的增大而增强,据此可定量分析甲基化酶。该检测方法可实现M.Sss I的高灵敏检测的目的,且能检测大肠杆菌中内源性Dam甲基化酶。该检测方法可根据分析物的不同对底物链进行特定的设计以测定其他的目标物,使得该方法具有通用性。
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