植物表皮毛作为表皮细胞所特化的最外层结构,不仅可以提高植物对逆境胁迫的抗性,还具有很好的抗虫防病毒的作用。同时,表皮毛由于其结构简单,也是研究植物细胞命运调控的模式系统。目前,植物中克隆了一些调控表皮毛形成的转录因子,包括MYB转录因子、b HLH转录因子、WD40转录因子等。最近,在许多模式植物中,包括拟南芥、番茄、水稻和玉米中,均发现长链非编码RNA（Lnc RNAs）参与许多生长发育过程和逆境胁迫响应。然而,Lnc RNAs是否参与表皮毛形成的调控以及如何调控仍然是未知的。因此,开展表皮毛中Lnc RNAs的鉴定以及解析Lnc RNAs在番茄腺毛形成过程中的作用具有重要意义。本实验室前期对Wo基因突变体LA3186、Ailsa Craig、LA3186中分离出的表皮毛进行转录组分析中确定了1303个Lnc RNAs,而且还观察到表皮毛形成过程中30个Lnc RNAs显著上调,29个Lnc RNAs下调。本研究在此基础上,对茸毛中高表达的Lnc RNAs采用转基因分析的方法鉴定其茸毛调控功能。我们发现在Wo基因突变体LA3186中超量表达lnc RNA170导致茸毛表型发现明显变化,表明Lnc RNAs确实参与番茄表皮毛形成的调控,为表皮毛分子机理的研究提供了新的思路。本论文主要研究结果如下:1.根据本实验室前期转录组分析的结果,结合表达分析确定Lnc RNA170在腺体毛中高表达。另外,通过生物信息学分析发现Lnc RNA170位于一个蛋白编码基因Solyc10g006360的互补链上。因此,推测二者可能均参与番茄茸毛的形成。2.根据Lnc RNA170和Solyc10g006360的c DNA序列和基因组序列,利用在线软件用于CRISPR载体构建的靶位点和超量表达载体以及启动子载体引物的设计。首先利用PTX和p201N Cas9分别构建了双靶点与三靶点CRISPR/Cas9-Lnc RNAs载体;利用p Hellsgate8构建了Lnc RNAs超量表达载体;利用p MV2-GUS构建了Lnc RNAs启动子驱动GUS载体。3.采用农杆菌介导的遗传转化方法,将目标载体导入到多毛番茄突变体LA3186中。获得转基因植株之后,利用PCR检测转基因植株的阳性率。结果表明,外源基因已整合到番茄基因组中且能稳定遗传。4.通过对转基因植株的表型分析,发现超量表达Lnc RNA170导致番茄茎干I型腺毛的数量明显减少,且表面附着一层短小的茸毛;另外,超量表达Solyc10g006360导致相似的表型,说明Lnc RNA170和Solyc10g006360均参与该型茸毛的形成。表达水平检测表明,Lnc RNA170超量表达植株中目的基因的表达的提高并不明显,而Solyc10g006360超量表达转基因植株中目的基因的表达显著提高。5.由于转基因植株的背景材料为Wo基因突变体LA3186,由于Wo基因纯合致死的特性,后代会发生表型分离。因此,为了确定我们的转基因材料含有Wo基因,我们进行了背景检测。利用Wo基因突变导致酶切位点的改变,采用PCR扩增结合酶切的方法进行检测,实验结果表明他们都含有Wo基因突变位点。6.根据靶位点所在位置的基因组序列信息,设计靶位点扩增引物。利用PCR扩增含有靶位点的片段,递交生物公司进行测序。测序结果与参考基因组序列比对结果显示,CRISPR Cas9转基因植株T0代有不同类型突变或缺失。比较奇怪的是,Lnc RNA898 CRISPR Cas9转基因植株中靶位点未发现编辑,但是其I型茸毛密度显著减少,茎表面短小的茸毛密度显著增加。推测发生此种现象的原因可能是脱靶导致非目标基因被编辑。