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研究背景急性心肌梗死是致死致残的全球性重大疾病。通过急诊经皮冠状动脉介入治疗或溶栓治疗尽早开通闭塞血管、恢复心肌灌注,是缩小心梗面积、改善预后的重要措施。然而,再灌注治疗过程会触发炎症级联反应,引起心肌缺血再灌注损伤,其中,单核细胞等固有免疫细胞在心肌损伤和修复过程中发挥重要作用。心肌缺血再灌注早期,大量促炎型的Ly6Chigh单核细胞在Monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）/C-C chemokine receptor type 2（CCR2）信号作用下招募至梗死部位,分泌促炎因子并吞噬坏死细胞碎片,进入后期,Ly6Chigh单核细胞向Ly6Clow单核细胞转化,发挥抑制炎症反应、促进心肌修复的作用。然而,早期的促炎反应往往是过度的,会加重心肌细胞的死亡及心功能的恶化,因此,适度控制炎症水平和Ly6Chigh单核细胞的活化,对于减少心肌细胞损伤,改善预后具有重要意义。迄今为止,尚无行之有效的抗炎策略可应用于临床防治心肌缺血再灌注损伤。内皮细胞在抗炎和抗血栓形成,维持血管稳态中发挥关键作用。生理状态下血液呈层流,作用于血管内皮细胞上的应力传导复合体,诱导核转录因子Krüppel-Like Factor 2（KLF2）表达上调,促进抑炎基因表达,使细胞呈现抗炎表型,通过直接接触和分泌外泌体等途径维持血管稳态;既往研究发现,KLF2转染的内皮细胞可以通过分泌外泌体调控动脉粥样硬化中单核/巨噬细胞的极化。外泌体,作为细胞间信号转导的重要载体,具有易于穿过生物屏障,无毒性,无致肿瘤性,无免疫原性,生物相容性好等诸多优点。KLF2转染的内皮细胞外泌体是否可以用来调节心梗后炎症风暴,减轻心肌缺血再灌注损伤,有待进一步研究。研究方法1)层流体系培养内皮细胞,实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）、免疫印迹分析（Western blot）等方法验证其抗炎效应和检测KLF2表达,构建KLF2过表达的内皮细胞系（KLF2-HUVECs）。2)利用超速离心法从KLF2-HUVECs培养上清液中提取外泌体（KLF2-exo）,并利用Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术及透射电镜对提取出的外泌体进行鉴定。3)构建小鼠心肌缺血再灌注模型,再灌注后即刻尾静脉内注射KLF2-exo,观察KLF2-exo是否对心肌缺血再灌注损伤及其诱导的心肌炎症反应具有治疗作用。4)运用流式细胞术、免疫荧光等方法观察KLF2-exo对小鼠体内不同类型单核/巨噬细胞的影响,并通过给小鼠尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体清除单核/巨噬细胞系统,观察清除后KLF2-exo对心肌的保护作用是否被削弱。5)运用流式细胞术、脾脏切除等方法,观察KLF2-exo对单核/巨噬细胞动员、极化和凋亡的影响。6)运用qRT-PCR、Western blot等方法探讨KLF2-exo抑制骨髓中单核细胞动员的具体分子机制,并在体外用Transwell试验和细胞划痕试验进行验证。7)通过对KLF2-exo进行microRNA测序并结合生物信息学分析,筛选出发挥作用的microRNA,利用体外功能学试验进行验证,并在相关数据库中预测microRNA靶基因,通过双荧光素酶报告基因检测进行验证。8)利用 microRNA antagomir 处理 KLF2-HUVECs,抑制 microRNA,提取外泌体（antagomir-exo）,观察其对心肌的保护作用是否被削弱。结果1)层流状态下培养的内皮细胞具有抗炎效应且KLF2表达升高,用KLF2慢病毒转染HUVECs成功构建KLF2过表达的HUVECs,能模拟层流状态下内皮细胞的抗炎效应。2)利用超速离心法可成功提取出直径在30-150nm,具有脂质双分子层结构,表达特殊表面标记的KLF2-exo。3)小鼠心肌缺血再灌注后即刻经尾静脉注射KLF2-exo能够改善小鼠心功能,减少心梗面积,抑制心室重构,减轻系统炎症反应。4)KLF2-exo能下调心肌组织内Ly6Chigh单核/巨噬细胞比例,单核/巨噬细胞系统被清除后,KLF2-exo对心肌缺血再灌注损伤的治疗作用被削弱。5)脾脏切除后,KLF2-exo对心肌缺血再灌注损伤的治疗作用仍存在;体内实验中观察到KLF2-exo通过下调CCR2蛋白表达,抑制骨髓中Ly6Chigh单核细胞动员。6)体外实验中观察到KLF2-exo通过下调CCR2蛋白表达,抑制RAW264.7细胞的迁移。7)相较于vec-exo,KLF2-exo中富含miRNA24-3p,能通过抑制CCR2转录后翻译,抑制体内骨髓Ly6Chigh单核细胞动员和体外RAW264.7细胞迁移。当KLF2-exo中miRNA24-3p被抑制后,KLF2-exo的调控作用被削弱。8)体内实验中观察到外泌体中miRNA24-3p被microRNA antagomir抑制后,外泌体的心肌保护作用被削弱。结论KLF2过表达的内皮细胞分泌的外泌体能抑制骨髓中Ly6Chigh单核细胞动员,从而有效改善小鼠心肌缺血再灌注损伤。这种作用是通过外泌体中的miRNA24-3p抑制单核细胞中CCR2的蛋白表达发挥的。