第一部分HP-1减弱CP引起的肾毒性反应保护肾功能研究背景:随着人们生活水平和健康意识的不断提高,很多以前未被发现的癌症患者,通过定期的健康查体被筛查确诊。美国癌症协会发布的数据展示,2018年全球有新增癌症病人1810万例,而其中因癌致死人数大约有960万人。抗癌药物的使用成为肿瘤治疗的必须手段,顺铂(CP)又称为顺氯氨铂,一种金属铂类络合物,因其抗肿瘤效果显著、癌谱广、价格便宜,为临床癌症治疗中用药比较广泛的化学物质。顺铂可与细胞核内的DNA结合,造成DNA损伤、破坏DNA的转录复制,并且高剂量时也可抑制RNA合成、蛋白质的装配。癌细胞较正常细胞代谢迅速因此对CP较为敏感,但CP治疗的无差别性往往也导致正常细胞受损,而引起诸多不良反应。尤其是肾脏损伤,因为顺铂主要通过肾脏排泄,大量累积于肾脏尤其是肾小管中,引起急性肾功能障碍,严重时肾小管坏死导致无尿。有文献报道,这些不良反应与顺铂治疗导致的炎症反应和细胞线粒体损伤有密切关系。中国中药疗法不良反应小、简单易接受、辅助治疗效果显著等特性,获得学界的广泛关注。槐耳,广泛见于我国华北地区多年生乔木树干上,是一种具有食用和药用价值的真菌,在中国可追溯的应用历史有上千年。在最近几十年的研究中,槐耳被证明具有潜在的抗肿瘤,提高系统免疫力的作用,因此被关注并应用于临床的辅助治疗。有报道发现,槐耳水提取物(主要成分为槐耳多糖,HP-1)通过其特异性免疫调节作用,减少炎性细胞渗出改善细胞生存环境,保护细胞线粒体功能。因此,在本文的论述开始我们通过提出假设,并依次开展基础实验来验证HP-1是否能减弱CP化疗引起的氧化应激反应,维护线粒体功能完整性保护细胞功能,减少炎性因子渗出改善细胞生存环境,从而能够保护肾功能减少肾损伤的作用。为此我们进行了大量的研究,希望在分子水平上探索可能存在的HP-1拮抗顺铂毒副作用的机理,希望为未来减轻CP的不良反应,提供可靠的参考策略。研究目的:1、评估体内环境下HP-1是否能减轻肾脏损伤。2、检测HP-1对CP引起细胞自噬激活和线粒体功能的障碍的影响。3、研究HP-1减弱CP诱导氧化应激压力的机制4、探索HP-1减弱CP导致肾脏炎症浸润机理。5、探讨HP-1能够减少CP细胞凋亡和周期抑制的生物学作用。6、探寻HP-1通过何种信号通路调节CP引起的不良反应。研究方法:1、CP诱导建立急性肾损伤的小鼠模型,并使用不同浓度的HP-1治疗。通过小鼠血清BUN、Cr浓度,评估小鼠肾功能,HE染色验证HP-1保护肾功能的效果。并通过western实验检测KIM-1蛋白水平,确定有无肾脏损伤。其次,通过电子透射显微镜(TEM)观察小鼠肾脏细胞的超微结构,镜下直观观察肾损伤的程度。2、电子透射显微镜观察小鼠肾脏细胞中自噬小泡数量、线粒体微细结构,评价HP-1拮抗CP引起细胞自噬和线粒体损伤的效果。通过western实验检测CP诱导后RTECs细胞中LC3-Ⅱ水平,并利用CCK-8实验评估体外细胞在HP-1应用后细胞活力的变化。同时,使用免疫荧光实验定性体外细胞中HP-1处理后LC3-Ⅱ的水平,以佐证体内LC3-Ⅱ的实验结果。3、利用western实验检测氧化应激相关蛋白的表达情况,并同时测定氧化应激相关指标MDA、ROS和GSH的水平,分析HP-1减弱CP诱导氧化压力的机制。4、首先,使用免疫组织化学,评估小鼠肾脏组织在HP-1治疗前后炎症代表因子TNF-α的表达水平。其次,使用western实验在分子水平检测HP-1治疗对炎症相关蛋白TNF-α、COX-2、IL-8、p-NF-K B的影响。最后,使用ELISA实验获得小鼠血清中TNF-α和IL-1 β的浓度。结合体内外实验找寻HP-1减少肾脏炎性浸润的机理。5、经免疫组织化学检测小鼠肾脏组织中Bax的表达水平,以鉴定小鼠肾脏细胞凋亡情况,经western实验测定与凋亡和周期有关联的蛋白表达水平。使用TUNEL检测体外细胞在HP-1处理后对CP诱导的拮抗作用,与western和流式细胞术互为佐证,使用流式细胞术验证western实验结果,证明HP-1减轻CP导致的凋亡损伤。6、经Western实验验证PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白表达情况。同时使用LY294002特异性PI3K通路抑制剂,证明HP-1通过PI3K-AKT通路调节CP引起的肾损伤的假设。7、使用人肾小管上皮正常细胞HK-2,按上述实验步骤验证,HP-1在人体细胞同样有对抗CP引起肾损伤的作用。研究结果:1、HP-1应用后显著改善肾功能,BUN、Cr水平虽未达到正常水平但较CP组相比已有回落。HE显示较CP组相比,HP-1治疗后肾小管和肾小球损伤减轻,蛋白质管型减少,KIM-1蛋白表达水平也减少,说明肾损伤减轻。TEM也观察到HP-1治疗后,细胞趋于正常,绒毛结构改善。同时未发现HP-1治疗对重要脏器造成毒副作用。2、电镜下自噬小体减少、线粒体质膜结构改善损伤减轻,自噬相关蛋白表达减少,说明HP-1治疗减轻了 CP引起的自噬和线粒体功能障碍。体外CCK-8实验选取合适的CP诱导和HP-1治疗浓度,并获得药物细胞活力数据。也通过免疫荧光实验证明HP-1治疗后,细胞自噬减少。3、与CP组相比,western实验证实HP-1处理后氧化应激相关蛋白表达水平具有所降低。氧化应激因子ROS和MDA水平也在HP-1治疗后被拉低,同时抗氧化应激因子GSH水平有所回升。这都标志着氧化应激得到有效控制,细胞功能得到改善。4、免疫组化证实HP-1能明显减少组织中炎症因子的表达,western也验证了相关炎症蛋白在使用HP-1后减少。同时,ELISA实验结果与western结果相同,认为HP-1通过减少炎症蛋白和炎症因子的表达减少炎症浸润。5、从体内、体外两个角度说明:一、小鼠肾脏组织中凋亡减少;二、流式细胞术和TUNEL都证明体外细胞凋亡数目在使用HP-1后减少;三、western结果显示凋亡起始蛋白和主要凋亡参与蛋白表达量降低,同时细胞周期进展相关蛋白表达恢复。说明HP-1使用后,无论体内还是体外细胞凋亡数目减少,且同时细胞周期得以恢复,个体功能得以更新和改善。6、HP-1通过减少PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化,阻滞信号通路上调控信号的传递,保护细胞免于药物引起的恶性凋亡。并通过增多GSK-3 β的表达,解除对细胞周期的抑制。并使用LY294002进一步验证PI3K-AKT-mTOR在HP-1治疗CP引起损伤中的功用。7、从人体细胞角度出发,证明在HP-1对人体细胞环境,同样起到减少氧化应激、减弱炎症反应、减少细胞凋亡的作用。研究结论:1、HP-1能够减轻CP诱导的急性肾功能损伤,改善肾功能。2、HP-1不具有器官毒性。3、HP-1减少CP诱导引起的细胞自噬。4、HP-1减弱CP导致的线粒体功能损伤。5、HP-1恢复细胞活力,并无明显的体外细胞毒性。6、HP-1阻滞药物导致的病理性氧化应激反应,减少相关炎症因子的浸润。7、HP-1减少炎性因子浸润和炎性蛋白表达,从而改善细胞生存环境。8、HP-1通过减少药物引起的病理性凋亡,修复受阻的周期进程,从而留存更多的器官功能。9、HP-1通过PI3K-AKT-mTOR信号传导途径减弱CP化疗引起的肾损伤。10、HP-1的治疗作用在人体细胞HK-2中获得相同的结果。第二部分HP-1抗肾细胞癌的生物学作用及机制研究研究背景:随着物质社会的发展和前进,人口素质的不断提高,公民健康意识逐渐增强,一部分肿瘤因普通查体被发现。例如肾癌,随着国家65岁以上老年人免费查体政策的实施,越来越多的病人因为主动筛查而被发现。在全世界范围内,肾癌大约占所有恶性肿瘤发病率的3%,并以每年2%的速度增长。同时,临床生活中肾癌也是泌尿外科最常见的实性病变,大约占肾恶性肿瘤的80%。在性别差异上,男女比例为1.5:1,男性多于女性,且发病年龄趋于老年化,以60-70年龄段最多。在病理学和遗传学上,具有不同的组织分型和遗传变异,其中尤以肾透明细胞癌(ccRCC)占比最高,大约占肾癌的80%。导致ccRCC的生物学基础中,最重要的一项可能是VHL的突变或功能缺失,从而导致了下游转录调节因子HIF-α的大量积蓄,进而转录上调VEGF等多种活性因子,激活一些列的激酶依赖性信号通路,如PI3K-AKT-mTOR通路。目前针对于ccRCC首选的治疗方式为手术切除,而对于终晚期患者已失去手术意义,需根据自身情况选择合适治疗方案。近年来针对于某些目标基因和目标蛋白,开发的靶向药物是终晚期肾癌患者的新希望,如人源化抗VEGF因子的单克隆抗体,小分子酪氨酸激酶抑制剂和mTOR抑制剂。舒尼替尼(Sunitinib)是一种可口服,多靶点的受体酪氨酸激酶抑制剂,其作用主要表现为抑制肿瘤血管生成,从而使瘤组织失去血液供应,致使养分不足达到“饿死”肿瘤细胞的效果。研究表明,在肾细胞癌治疗中,该药主要阻断VEGF和PDGF信号通路下游的几种受体发挥抗癌作用,其中包括:PDGFR,VEGFR。但随着药物的应用,其副作用和肿瘤的药物抵抗性逐渐显现出来,进而限制了它的临床应用。中药槐耳是一种大型真菌,主要生长在中国华北地区的多年生乔木树干上,具有食用和药用价值,同时槐耳及其水提取物HP-1有提高机体免疫力、保护器官功能完整性的功效;还具有抑制氧化反应、减少炎性浸润、增强某些药物的治疗敏感性和主动激活免疫系统的防御能力等作用。我们采用CCK-8实验、集落形成实验、划痕实验和Transwell实验证明,HP-1可有效减缓肿瘤进展过程。并且在HP-1与Sunitinib结合使用时,通过诱导凋亡和细胞周期阻滞,增强了Sunitinib的抗肿瘤特性。HP-1的一系列作用,是通过依赖于下调CIP2A的表达和镇压上皮细胞-间充质转换(EMT)来实现的。而且,实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验显示,HP-1与Sunitinib联合治疗后CIP2A下调尤为明显,并且认为与EMT被抑制有关。此外,HP-1使用后PI3K/AKT/VEGFR通路多种主要蛋白表达水平下调,如p-AKT,而p-AKT的下调使这条轴线上一些列的蛋白激活受到抑制,从而使诸如凋亡等细胞活动被激活,在整体上表现为癌细胞的死亡,并且这种趋势在HP-1与Sunitinib联用时也有增强的效果。在体内异种移植的小鼠模型中也观察到,HP-1使用后瘤体的无论是生长速度还是瘤体体积都较Control组受抑制,最为显著的差异表现在联合用药组,说明与Sunitinib联用增强了 Sunitinib抗肿瘤生长的作用。综上所述,提示HP-1具有一定抗肾细胞癌(RCC)的作用,并且能够增强Sunitinib的治疗效果。研究目的:1、评估HP-1是否能够抑制肿瘤细胞的活力,并增强肾癌细胞对Sunitinib的敏感性。2、评估HP-1、HP-1联合Sunitinib抑制肿瘤细胞增殖的效果。3、观察HP-1、HP-1联合Sunitinib使用时对786-0和A498运动能力的影响。4、观察HP-1、HP-1联合Sunitinib使用时786-0和A498侵袭的能力的变化。5、通过对肾癌细胞周期的检测,探索HP-1、HP-1联合Sunitinib应用影响周期的机制。6、通过对肾癌细胞凋亡的检测,探讨HP-1、HP-1联合Sunitinib如何诱导细胞凋亡。7、探寻HP-1及药物联用是否通过调控CIP2A基因和其对应蛋白表达,影响肾癌细胞活力和转移侵袭能力。8、研究HP-1及联合用药时,经EMT和PI3K-AKT-VEGFR通路抑制肿瘤细胞生长的分子学机制。9、体内实验探索HP-1及与Sunitinib联合应用时对肿瘤生长的抑制机制。研究方法:1、CCK-8测定不同浓度HP-1、HP-1与Sunitnib联合应用时,肿瘤细胞的细胞活力变化;集落形成检测测定药物处理后,786-0和A498增值能力的变化;显微镜下观察786-0和A498在药物处理后形态学变化。2、划痕实验测定药物处理后,对786-0和A498活动能力的影响;Transwell实验测定HP-1及联合Sunitnib应用后,对786-0和A498转移和侵袭能力的影响。3、流式检测药物处理后,786-0和A498细胞周期的分布情况;western测定药物处理后,786-0和A498蛋白表达变化情况。4、流式检测786-0和A498在药物处理前后凋亡比列情况;western检测对应凋亡蛋白的表达。5、PCR测定CIP2A转录水平,并结合western检测CIP2A蛋白的翻译水平,同时IF定性分析补充说明。过表达CIP2A测定HP-1、HP-1及Sunitinib联合应用时,对细胞活力、运动能力的影响。6、HP-1、HP-1 与 Sunitinib 联合应用后,western 实验测定 EMT 及 PI3K-AKT-VEGFR通路主要蛋白的表达情况。7、体内实验验证HP-1及联合用药对肿瘤生长的抑制,并使用PCR和western分析其内在的生物学机制。研究结果:1、HP-1降低肾癌细胞的活力,在Sunitinib联合HP-1使用时比单独用Sunitinib对细胞活力抑制更强,且都存在药物的时间和浓度依赖性。同时,药物联合应用肾癌细胞集落形成的能力更弱,且细胞的形态学变化明显。2、HP-1处理减弱786-0和A498运动能力,抑制了细胞增殖和侵袭。在Sunitinib合用HP-1后,Sunitinib抑制肿瘤效果更显著。3、联合用药较单独用药使更多的细胞阻滞在G1期,且周期进展蛋白cyclin-D、cyclin-E表达减少而周期抑制有关蛋白p21 Cip1、p27 Kip1表达增多。4、凋亡相关蛋白caspase-3、Bax表达增多,且流式细胞术显示HP-1、HP-1及Sunitinib联合使用都诱导了细胞凋亡,但联合用药比单独用药效果显著。5、药物处理后肾癌细胞活力减弱、增殖和侵袭受到抑制,是CIP2A基因表达受到抑制、CIP2A蛋白表达减少的结果。6、药物处理后EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug表达减少,E-cadherin表达增多。有生物活性的PI3K、AKT减少,GSK-3β、VEGFR蛋白在药物处理后表达水平也降低。7、较Control组相比,小鼠异种移植瘤在HP-1处理后体积减小,且Sunitinib联合HP-1处理后所获瘤体最小。PCR分析显示,药物处理后肿瘤中CIP2A基因表达减少。Western实验展示了细胞周期、细胞凋亡、EMT过程、PIEK-AKT-VEGFR信号通路相关蛋白的表达情况,蛋白表达整体上说明癌细胞生物进程被抑制。研究结论:1、HP-1能抑制了肾癌细胞活性,减弱肿瘤细胞增殖和侵袭的能力。2、HP-1通过诱导肾癌细胞凋亡、阻滞肾癌细胞周期进展达到抑制肿瘤的效果。3、HP-1通过对CIP2A转录水平的调控,影响其后蛋白的合成,增强了癌细胞对药物的敏感性。4、HP-1能够通过调控EMT、PI3K-AKT-VEGFR/GSK-3β等多条信号通路,逆转EMT过程、激活癌细胞主动凋亡、阻滞肿瘤异常血管的增生。5、体内环境下,HP-1通过减少CIP2A表达,逆转EMT过程,诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期和降低PI3K-AKT-VEGFR通路活性,减缓裸鼠瘤的生长速度。6、在Sunitinib与HP-1联合应用时,Sunitinib药物效果较单独使用时更好,说明HP-1增强了肿瘤细胞对Sunitinib的药物敏感性。