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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV2)是迄今发现的一种最小的动物病毒,具有致病性,可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。其主要的临床表现为：呼吸道症状、贫血、黄疸、生长迟缓和进行性消瘦等。PCV2能引起机体的免疫抑制,易与多种细菌、病毒混合感染。1991年首次在加拿大南部发现PMWS,我国于2000年证实在猪群中存在PCV2的感染。目前该病已遍及世界多个国家和地区,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。14-3-3蛋白是一类能与磷酸化蛋白结合或分离,调节细胞生理功能活性的蛋白质。其具有伴侣蛋白的性质,广泛参与细胞周期的调控,细胞的增殖与分化,信号转导,DNA损伤修复,肿瘤的形成等生理活动。14-3-3蛋白属于一类高度保守的蛋白质家族,在真核动物中具有高度保守性,按其蛋白结构的亚基不同,分为7个亚型(a,γ,β,η,θ,σ和ζ)。其中14-3-3σ蛋白又称为stratifin(SFN),分子大小约为28kDa。研究表明,14-3-3σ可与细胞周期蛋白复合物结合,调控病毒在细胞内的复制；还能与一些抑癌基因相互作用,调节细胞周期的检查点,对细胞的增殖起重要的调控作用。本课题是研究14-3-3a对PK-15细胞的作用,及其对PCV2增殖的影响,结果如下：1.构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-SFN根据GenBank上公布的猪SFN基因序列(GI：113205699)设计引物,通过RT-PCR方法扩增了猪SFN基因的CDS序列,将之插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒,命名为pcDNA3.1(+)-SFN。通过PCR扩增、酶切鉴定及测序比对分析,发现该序列与GenBank中登录号为DQ445254(GI:90811814)的猪SFN基因同源性为99%。将真核表达质粒pcDNA3.1(+)-SFN转染到PK-15细胞中,通过间接免疫荧光和Western Blot进一步分析证实pcDNA3.1(+)-SFN构建成功。荧光显微镜观察SFN在细胞浆和细胞核中都有分布。2.超表达SFN对PCV2增殖的影响将真核表达质粒pcDNA3.1(+)-SFN转染到PK-15细胞中,24h后接种PCV2病毒,观察接毒后不同时间点转染SFN对病毒滴度的影响。实验表明,SFN不利于PCV2在细胞内的复制,差异显著(p≤0.05或p≤0.01)。随着时间的变化,这种抑制作用持续稳定,在12、24、36h时PCV2的拷贝数分别是对照组的0.97、0.86、0.9倍,SFN有可能在PCV2感染和复制的过程中起到抑制病毒增殖的作用。3.PCV2和SFN基因对PK-15细胞周期的影响鉴于SFN对细胞周期的作用,为了揭示SFN对PCV2增殖的影响,将pcDNA3.1(+)-SFN转染到PK-15细胞后,用流式细胞仪检测不同时间各时相的分布情况,发现随着时间的推移,SFN使PK-15细胞的S期延长,差异显著(p≤0.05或p≤0.01),表明SFN对细胞周期产生阻滞作用。转染SFN于PK-15细胞24h后接种PCV2,于接毒后不同时间点观察对细胞周期的影响。结果显示随着时间的推移,接种PCV2的细胞周期S期增大,而转染了SFN的PK-15细胞S期的延长更为显著,同时G2/M期处于静息状态。