烟草青枯病生防菌X23中非核糖体肽类抗生素edeines的高产改造

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芽孢杆菌在农业生产上,包括植物病虫害生物防治、促进作物生长和提高作物抗逆能力等方面有着广泛的应用。短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis)菌株X23产生的非核糖体肽类抗生素edeines(伊短菌素),具有抗菌活性强和抗菌谱广的特点,该菌株作为茄科作物青枯病的生防菌已经被大面积应用。菌株X23中伊短菌素的生物合成途径不明、产量偏低,且该类化合物的化学合成复杂、步骤繁琐且成本昂贵,限制了其作为农用抗生素的应用前景。本论文运用重组工程、转录组测序和生物信息学分析等技术,研究了不同启动子类型及全局性调控因子改造对短短芽孢杆菌菌株X23合成伊短菌素的产量的影响。主要研究结果如下:(1)通过启动子替换,构建了高效表达伊短菌素的工程菌株。通过生物信息学分析,明确了ede operon的启动子区域,并利用Red/ET同源重组技术,分别将6个组成型表达的启动子替换了ede operon的启动子,获得了X23(Pede::Pmwp)、X23(Pede::Pgrac)、X23(Pede::Pxyl A)、X23(Pede::Pspc)、X23(Pede::Pshuttle-09)和X23(Pede::P43)等6株高产伊短菌素的工程菌株。并从平皿拮抗、液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)以及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析等三个方面对工程菌株的产量进行评价,结果表明:工程菌株X23(Pede::Pmwp)中ede operon的表达水平提高了约15.40倍,产量增加了14.78倍,达到83.4μg/m L,其他5株工程菌的伊短菌素的产量也有不同幅度的增加,增幅介于4.64至9.17倍之间,由高到低依次是X23(Pede::Pgrac)、X23(Pede::Pxyl A)、X23(Pede::Pspc)、X23(Pede::Pshuttle-09)和X23(Pede::P43)。(2)基于转录组测序、分析及实验验证,发现abr B是伊短菌素合成的负调控基因。本论文从Br.brevis X23基因组中挖掘到了1个全局性转录负调控因子Abr B,通过基因敲除获得全局性转录调控因子缺失的突变株,然后采用平皿对峙培养、HPLC-MS和q RT-PCR研究了敲除全局性负调控因子对Br.brevis X23菌株不同生长时期发酵液的抑菌活性、伊短菌素产量、ede操纵子转录水平的影响。结果表明:敲除abr B基因后ede operon的转录水平在生长前期显著提高,在发酵48 h后abr B突变株中edeine A和edeine B总产量比野生型菌株提高了1.10倍。
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