动脉粥样硬化是一种由炎症、固有免疫以及脂质浸润等多种因素引起的慢性炎症反应，能够引起包括冠状动脉、外周动脉在内的多种血管病变，严重危害人类健康。微小RNA是一类长度约19～25 nt的单链非编码RNA分子，主要通过在转录后水平调控目标基因表达参与生物的发展以及组织、器官的形成。其中，miR-145在维持平滑肌功能以及AS的发生、发展中具有重要作用。CD137作为肿瘤坏死因子受体家族中的一员，主要表达在T细胞表面，通过与其配体CD137L结合，激活后引起下游一系列免疫、炎症反应。最新研究表明，CD137在AS的发生、发展中起着重要作。NFATc1是一类重要的核转录因子，参与了炎症、心脏瓣膜形成、T细胞激活以及破骨细胞生成等多种生物进程。我们前期实验显示，刺激CD137-CD137L轴能够促进ApoE-/-小鼠斑块的形成，诱导斑块中淋巴细胞的激活和增殖，并促使NFATc1表达增加;在前期实验中，我们发现应用刺激性CD137抗体刺激淋巴细胞后，NFATc1表达显著增高，证实NFATc1是CD137信号通路的下游分子。然而，CD137分子信号如何调控NFATc1尚不清楚，是否存在中间环节有待进一步阐明。生物信息学分析显示NFATc1可能是miR-145a-5p的下游靶点，而自身免疫疾病大鼠模型中CD4+T细胞中过表达miR-145能明显抑制NFATc1表达，提示:miR-145是NFATc1的上游分子。然而，CD137是否通过miR-145调节NFATc1的表达而影响AS的形成目前尚不清楚。因此，本实验拟从以下几方面探讨CD137分子信号是否通过miR-145调控NFATc1的表达。　　研究目的:　　1.体内、外用CD137抗体激活CD137轴后，检测miR-145及NFATc1水平改变。　　2.检测miR-145水平变化对NFATc1表达的影响。　　3.初步探索CD137、miR-145以及NFATc1在平滑肌细胞中对细胞增殖、迁移的作用　　4.ApoE-/-小鼠中，体外上调miR-145水平后观察斑块的改变。　　研究方法:　　1.体内、外用CD137抗体激活CD137轴后，检测miR-145及NFATc1水平改变。　　1.1体内激活CD137轴，检测ApoE-/-小鼠颈动脉miR-145及NFATc1水平改变　　8周雄性ApoE-/-小鼠颈动脉置管后腹腔注射CD137激活型抗体，4周后取颈动脉提蛋白，Western Blot检测NFATc1蛋白水平;提RNA，PCR检测NFATc1mRNA及miR-145表达水平。免疫荧光检测NFATc1分布。　　1.2 CD137抗体刺激平滑肌细胞后，检测miR-145及NFATc1水平改变　　原代培养平滑肌细胞，TNF-α(10ng/ml)预处理24h后，CD137抗体（10μg/ml）刺激细胞24h;提蛋白，Western Blot检测NFATc1蛋白水平;提RNA，PCR检测NFATc1 mRNA及miR-145表达水平。　　2.检测miR-145水平变化对NFATc1表达的影响。　　2.1分析miR-145对NFATc1的作用靶点　　通过靶基因预测软件targetscan以及pictar分析miR-145有可能发挥作用的靶点，构建含有/不含有相应靶点3 UTR区的真核表达质粒，与microRNA mimic转染细胞后，分析相应外源蛋白变化，初步验证miR-145的作用靶点。　　2.2 miR-145对CD137/NFATc1轴的影响　　将miR-145 mimic或inhibitor转入平滑肌细胞，分别以抗体激活/阻断CD137轴，24h后q-PCR检测NFATc1 mRNA水平，Western blot检测NFATc1蛋白表达变化。　　2.3分子克隆构建双荧光素酶报告基因载体　　将NFATc1含有靶点区域的3UTR段通过PCR扩增后，经酶切连接构建入psicheck-2质粒。通过点突变试剂盒对psicheck-2质粒目标靶点核心区域进行突变后，将野生型质粒，突变质粒与miR-145mimic或mimic control共转染至293T细胞，48h后检测其荧光表达水平。　　3.初步探索CD137、miR-145以及NFATc1在平滑肌细胞中对细胞增殖、迁移的作用　　3.1慢病毒介导NFATc1基因长期沉默的细胞株，miR-145过表达细胞株及对照细胞株的构建　　利用慢病毒转基因技术，构建沉默NFATc1、过表达miR-145及对照组的慢病毒质粒，并命名为PLKO.1-shNFATc1、PLKO.1-miR-145、PLKO.1-Con使它和包装质粒一起共转染293T细胞，生产病毒，转染平滑肌细胞，嘌呤霉素筛选并克隆式培养稳转细胞株。Q-PCR分别检测沉默细胞株及过表达细胞株中NFATc1或miR-145的表达。　　3.2长期沉默NFATc1或过表达miR-145对CD137刺激引起的细胞功能影响　　TNF-α(10ng/ml)预处理24h后，CD137抗体（10μg/ml）刺激细胞24h，CCK8法检测细胞增殖能力的变化，划痕实验及transwell实验检测细胞迁移能力的变化。　　4.ApoE-/-小鼠中，体外上调miR-145水平后观察斑块的改变　　4.18周ApoE-/-小鼠除CD137抗体刺激外，皮下注射miR-145agomir(10mg/kg/week)。3个月后取腹主动脉，测定斑块及炎症相关指标。　　研究结果:　　1.动物实验及细胞实验中，CD137轴激活可引起miR-145和靶基因NFATc1的表达改变，且miR-145与NFATc1趋势相反。　　1.1 CD137抗体刺激的ApoE-/-小鼠颈动脉斑块中，miR-145显著降低，NFATc1mRNA水平及蛋白水平升高。同时注射CD137阻断型抗体则可逆转该现象。　　1.2 CD137抗体刺平滑肌细胞中，miR-145表达降低，NFATc1蛋白水平升高。抑制CD137可出现相反趋势。　　2.miR-145通过作用于NFATc1的3UTR来抑制NFATc1的表达　　2.1 miR-145可与NFATc1的3UTR相互作用　　经软件预测分析发现，NFATc13UTR的362-368可能是miR-145的结合位点。因此，我们构建了含有该作用位点以及不含有作用为点的NFATc1过表达载体。miR-145 mimics和质粒共转染实验证实了miR-145确实可作用于NFATc1的3UTR，从而抑制NFATc1的表达。　　2.2 CD137通过miR-145调控NFATc1表达　　为了验证miR-145是否是CD137/NFATc1通路的中间环节，我们在平滑肌细胞转染mimic上调miR-145表达后，给予CD137抗体刺激;拮抗CD137同时，转染inhibitor下调miR-145。结果表明，CD137对NFATc1的调控，可能是通过miR-145进行的。　　2.3体外验证miR-145可作用于NFATc1靶点　　含有miR-145作用靶点的双荧光素酶报告基因质粒，荧光活性可明显被mimic抑制。然而将靶点的核心区域处进行点突变后，荧光活性则不受mimic影响。体外验证了miR-145在NFATc1上靶点的有效性。　　3.CD137能通过miR-145及NFATc1促进平滑肌细胞的增殖、迁移　　3.1慢病毒介导NFATc1基因长期沉默与miR-145过表达的细胞株及对照细胞株的构建　　成功包装出具有感染力的病毒，并通过嘌呤霉素筛选获得PLKO.1-shNFATc1、PLKO.1-miR-145、PLKO.1-Con稳转细胞株，Q-PCR鉴定其效果。　　3.2过表达miR-145或沉默NFATc1能够抑制CD137对平滑肌细胞增殖、迁移的促进作用　　PLKO.1-Con细胞株在CD137刺激下，增殖、迁移能力增强，而PLKO.1-shNFATc1、PLKO.1-miR-145细胞株CD137刺激下未见明显细胞功能改变。　　4.ApoE-/-小鼠中过表达miR-145能减轻CD137轴激活引起的血管斑块　　4.1 miR-145能抑制斑块形成　　腹主动脉切片染色显示，miR-145过表达的血管中，斑块面积明显减少，纤维帽明显增厚，并且巨噬细胞聚集也较对照组减少。　　4.2 miR-145能减少斑块中炎症相关分子表达　　q-PCR显示，miR-145过表达的小鼠腹主动脉血管中，炎症相关因子如NFATc1、MMP-2、IL-2等mRNA水平显著降低。　　研究结论:　　1.CD137轴激活能够在体内、外下调miR-145表达水平，并且上调miR-145靶基因NFATc1的表达。　　2.通过软件预测和构建一系列含有或不含有靶点位置的质粒，从分子水平证明miR-145通过与NFATc1的3UTR相互作用，从而抑制其蛋白的表达。　　3.CD137轴激活能够促进平滑肌细胞的增殖、迁移能力，并且增殖、迁移能力与miR-145及NFATc1的有关。　　4.动物实验表明，miR-145可以拮抗CD137轴激活所引起的斑块形成，具有保护性作用。