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目的采用基因工程和分子生物学的方法，构建体外表达Toll样受体及与热原反应相关基因的细胞学模型，为检测注射剂的热原反应提供实验室使用工具。方法克隆人Toll样受体4（TLR4）和髓样分化蛋白（MD2），构建pcDNA.3.1/myc-His(-)B-TLR4、pcDNA.3.1/myc-His(-)B-MD2真核表达载体。①pMD19-T-TLR4、pMD19-T-MD2克隆载体的构建及鉴定：提取人外周血单核细胞总RNA，利用RT-PCR得到TLR4-1、TLR4-2和MD2的DNA。回收PCR产物连接于pMD-19T载体上进行克隆和测序。②pcDNA.3.1/myc-His(-)B-TLR4表达载体的构建及鉴定：测序鉴定后的pMD19-T-TLR4-2载体质粒与pcDNA.3.1/myc-His(-)B表达载体质粒同时进行EcoRI和XhoI双酶切，经连接酶作用后，转化至感受态E.coliTop10，氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆并酶切鉴定，得pcDNA.3.1/myc-His(-)B-TLR4-2载体质粒。鉴定合格的pcDNA.3.1/myc-His(-)B-TLR4-2载体质粒与pMD19-T-TLR4-1载体质粒同时进行hpaI和BamHI双酶切，经连接酶作用后，转化至感受态E.coliTop10，氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆并酶切鉴定，最终获得pcDNA.3.1/myc-His(-)B-TLR4载体质粒。③pcDNA.3.1/myc-His(-)B-MD2表达载体的构建及鉴定：pMD19-T-MD2载体质粒与pcDNA.3.1/myc-His(-)B载体质粒均以KpnI和XhoI分步双酶切，经连接酶作用后，转化至感受态E.coliTop10，氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆并酶切鉴定，得pcDNA.3.1/myc-His(-)B-MD2载体质粒。④将pcDNA.3.1/myc-His(-)B-TLR4-1和pcDNA.3.1/myc-His(-)B-MD2通过电穿孔转染法转入HEK293细胞，在mRNA水平观察TLR4及MD2基因的表达。结果①利用RT-PCR成功获得人TLR4-1、TLR4-2及MD2的cDNA，构建pMD-19T-TLR4-1、pMD-19T-TLR4-2和pMD-19T-MD2质粒载体经酶切鉴定、测序及BLAST分析，得到重组质粒。②构建pcDNA.3.1/myc-His(-)B-TLR4和pcDNA.3.1/myc-His(-)B-MD2质粒载体经酶切鉴定、测序及BLAST分析，得到重组表达载体。③通过电穿孔转染法，将pcDNA.3.1/myc-His(-)B-TLR4-1和pcDNA.3.1/myc-His(-)B-MD2转染HEK293细胞后，在mRNA水平证明： TLR4和MD2基因有表达。结论成功构建表达Toll样受体及与部分热原反应相关基因的表达载体，即人TLR4和MD2基因的真核表达载体pcDNA.3.1/myc-His(-)B-TLR4和pcDNA.3.1/myc-His(-)B-MD2，为构建人TLR4及MD2基因敲入细胞学模型做前期准备。