自从Edward Jenner接种牛痘预防天花以来,疫苗为人类的健康做出了巨大贡献。一般认为,疫苗的发展可以分为三个阶段：即以减毒活疫苗和灭活疫苗为代表的第一代疫苗,以重组基因工程蛋白亚单位疫苗为代表的第二代疫苗,以核酸疫苗为代表的第三代疫苗。然而随着医学微生物学和免疫学等生物医学科学技术的快速发展,疫苗种类迅速增加,同时也带来了许多新的问题,如免疫次数增多、免疫程序复杂等等。 联合疫苗由于能够减少免疫接种次数、简化免疫程序、提高免疫覆盖率,因此已经成为当今疫苗研究的热点。目前上市的联合疫苗中,主要采用减毒活疫苗/灭活疫苗(第一代疫苗)和重组亚单位疫苗(第二代疫苗)进行联合制备,而有关重组蛋白亚单位疫苗(第二代疫苗)和核酸疫苗(第三代疫苗)之间的联合疫苗的研究尚未见报道。蛋白疫苗和核酸疫苗各有其特点：蛋白疫苗通常能够诱导较高水平的抗体,适用于预防病原生物的感染,而诱导特异性细胞免疫应答的能力一般较弱；核酸疫苗通常能够引起较强的特异性细胞免疫应答,对于难治性感染性疾病具有治疗性作用,但是相对蛋白疫苗而言其诱导的抗体水平较低。因此根据不同的需要组成联合疫苗,赋予联合疫苗更多特点就成为一个吸引人的新课题。 本研究以乙型肝炎和戊型肝炎联合疫苗为模型,通过蛋白-核酸共免疫的方法,研究蛋白疫苗和核酸疫苗组成的联合疫苗的免疫原性,围绕蛋白疫苗和核酸疫苗组成联合疫苗的可行性和作用机制作一初步探讨。 本研究主要分为两部分： 第一部分；基于重组乙肝亚单位疫苗和戊肝核酸疫苗的新型HBV-HEV联合疫苗的研究 在以往有关重组乙肝亚单位疫苗和戊肝核酸疫苗研究的基础上,采用重组乙肝亚单位疫苗和戊肝核酸疫苗制备乙肝-戊肝联合疫苗(HBV-HEV联合疫苗),通过研究该新型联合疫苗的免疫原性、组分间的相互作用,为研究第二代疫苗和第三代疫苗组成联合疫苗的可行性提供依据。 主要实验过程：将通过抽提质粒pVAX-179TH制备的重组戊肝核酸疫苗和长春生物制品研究所赠予的重组乙肝亚单位疫苗物理混匀,采用大腿肌肉注射的免疫方式免疫小鼠。免疫程序为0、2、4周。分组和免疫剂量如下：单价乙肝亚单位蛋白疫苗对照组为1.5μg/只；单价戊肝核酸疫苗对照组为100μg/只；低剂量联合免疫组为每只小鼠注射由1.5μg重组乙肝亚单位疫苗与100μg戊肝核酸疫苗组成的联合疫苗；高剂量联合免疫组为每只小鼠注射由3μg重组乙肝亚单位疫苗与200μg戊肝核酸疫苗组成的联合疫苗。最后,通过ELISA检测血清IgG抗体和IgG抗体亚类,统计数据,评价结果。 本研究发现,由重组乙肝亚单位蛋白疫苗与重组戊肝核酸疫苗组成的候选联合疫苗能够诱导产生较强的针对乙肝病毒和戊肝病毒的抗体应答,并且抗体水平不低于单价对照。在第4周各组乙肝抗体阳转率达到100％,在第8周各组戊肝抗体阳转率达到100％,且抗体均能持续24周以上,显示出良好的免疫原性。高剂量的联合疫苗诱导的戊肝抗体水平高于低剂量联合疫苗组,差异具有统计学意义。抗体亲和力的检测发现各组诱导的乙肝和戊肝抗体亲和力差异不明显。表明不同剂量的联合疫苗虽然没有表现出抗体亲和力的增强,但与单价疫苗相比,联合疫苗的乙肝和戊肝抗体亲和力也没有表现出受到削弱。 抗-HBs IgG抗体亚类显示出以IgG1为主,而抗-HEV IgG则以IgG2a为主；提示乙肝亚单位疫苗诱导的免疫应答方向可能以体液免疫为主,戊肝核酸疫苗诱导的免疫应答方向可能以细胞免疫为主。低剂量联合疫苗组的抗-HBs IgG的亚类IgG2a/IgG1的比例高于单价乙肝亚单位蛋白疫苗组。表明联合疫苗能够促进乙型肝炎病毒特异性的Th1方向的免疫应答,并且在一定的剂量范围内,高剂量的联合疫苗更能增强这种效果。 第二部分：基于乙肝核酸疫苗和重组戊肝亚单位疫苗的新型HBV-HEV联合疫苗的研究 上述由乙肝亚单位疫苗和戊肝核酸疫苗组成的联合疫苗有其可行性,如果反之,以乙肝核酸疫苗和戊肝蛋白疫苗组成的联合疫苗会产生怎样的结果?因此,我们进一步开展了基于重组戊肝亚单位疫苗和乙肝核酸疫苗的新型HBV-HEV联合疫苗的研究。 主要实验过程：首先将通过抽提核酸质粒pVAON-S2/S制备的重组乙肝核酸疫苗和本实验室所制备的重组戊肝亚单位疫苗物理混匀。然后免疫小鼠,免疫方法为小鼠大腿肌肉注射免疫。免疫程序为0、2、4周。具体分组和免疫剂量为：单价乙肝核酸疫苗对照组为pVAON-S2/S100μg/只；单价戊肝蛋白疫苗对照组为1μg/只；低剂量联合疫苗组为每只小鼠注射由1μg重组戊肝亚单位疫苗与100μg乙肝核酸疫苗组成的联合疫苗；高剂量联合免疫组为每只小鼠注射由2μg重组戊肝亚单位疫苗与200μg乙肝核酸疫苗组成的联合疫苗。最后,通过ELISA检测血清IgG抗体和IgG抗体亚类,统计数据,评价结果。 研究发现,由重组乙肝核酸疫苗与重组戊肝蛋白疫苗组成的候选联合疫苗能够诱导产生较强的针对乙肝病毒和戊肝病毒的抗体应答,并且抗体水平不低于单价对照；在第6周乙肝抗体阳转率达到100％,在第4周戊肝抗体阳转率达剑100％,且抗体均能持续20周以上,显示山良好的免疫原性。低剂量的联合疫苗诱导的戊肝抗体水平高于单价戊肝蛋白疫苗组,并且差异具有统计学意义,表明联合疫苗中的乙肝核酸疫苗促进了戊肝抗体的产生,乙肝核酸疫苗在联合疫苗的免疫过程中起了佐剂的作用。但联合疫苗的不同剂量之间乙肝和戊肝的总IgG水平差异不明显。 抗体亲和力的检测发现各组诱导的乙肝和戊肝抗体亲和力差异不明显。表明不同剂量的联合疫苗虽然没有表现出增强的抗体亲和力,但与单价疫苗相比,联合疫苗的乙肝和戊肝抗体亲和力也没有表现出受到削弱。 抗-HBs IgG抗体亚类显示出以IgG2a为主,而抗-HEV IgG则以IgG1为主,提示联合疫苗诱导的乙型肝炎病毒的特异性免疫应答可能以细胞免疫为主,戊型肝炎病毒特异性免疫应答可能以体液免疫为主。高剂量联合疫苗组的抗-HEV IgG的亚类IgG2a/IgG1的比例高于低剂量联合疫苗组,表明在一定剂量范围内,高剂量联合疫苗能够促进诱导戊型肝炎病毒特异性的Th1方向免疫应答的能力。总结两部分实验内容,可以发现两种不同组成模式的蛋白-核酸联合疫苗免疫原性良好,联合疫苗中两种组分均能诱导出特异性抗体。不同的组成模式可能会带来组分间的不同的相互作用：在一定剂量范围内,联合疫苗的核酸疫苗组分可能会促进蛋白成分的免疫应答。表明该新型联合疫苗具有其可行性,值得做进一步的研究。