胰岛素抵抗是指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于正常，表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的摄取障碍及肝葡萄糖输出增多。由于胰岛素的生物效应系通过一系列信号蛋白来发挥作用，任一信号蛋白的结构或功能异常，均将导致信号传递障碍，发生胰岛素抵抗。由于信号传递复杂、影响因素繁多，胰岛素抵抗产生的机制尚不十分清楚。建立的体外胰岛素抵抗模型虽简化了影响因素，易于研究其发生机制，但因细胞来源、诱导因素、检测手段等的差异，得出的结果很不一致。而且体外胰岛素抵抗模型与体内胰岛素抵抗的形成条件、检测手段相差甚远，不适于研究体内胰岛素抵抗的发生机理。基于体内胰岛素抵抗是在胰岛素存在下的长期的、慢性的病理过程，因此，本实验采用地塞米松与胰岛素联合作用，体外诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗，并用经微量化后的临床糖检测试剂盒测量细胞对葡萄糖的摄取，并对胰岛素抵抗产生的分子机制进行研究。在此基础上，以临床常用的胰岛素增敏剂罗格列酮作为阳性药，对广泛用于治四川大学博士学位论文摘要疗搪尿病的中草药粗提物进行筛选，以期获得另种胰岛素增敏剂，为新胰岛素增敏剂的开发及临床应用奠定基础。为测定胰岛素抵抗模型糖的变化，我们对广泛用于临沐的Gol)一l，0l)糖检测试剂盒进行了微量化测试，结果发现检测体积缩小后，光密度吸收值0I)仍与检测液中葡萄糖的含量呈正比，0D值的大小可以代表葡萄糖含量的多少，说明GOD一尸OD法微量化测试是可行的。为进一步验证GOD一POD法微量化测试的可行性，我们利用胰岛素促进靶细胞摄取葡萄糖这一特性，用G00一尸()I)法微量化检测3T3一11脂肪细胞和HepGZ细胞的糖代谢。结果证明，本实验建立的GOD一尸OD法微量化测试结果仍然可以反应胰岛素的这一特性，说明GO口一l〕OD法微量化测试是成功的。在此基础__匕本文模拟体内胰岛素抵抗产生的条件，在体外用地塞米松和胰岛素联合作用3f3一Ll月旨肪细胞，用己建立的GOD一尸OD微量化测定法检测细胞摄取葡萄糖的变化。结果显示，地塞米松/胰岛素作用3rl3一L工脂肪细胞后，细胞摄取葡萄糖的能力降低，残存在培养基中葡萄糖增多，细胞产厂1了胰岛素抵抗。用临床上常用的胰岛素增敏剂罗格列酮作用抗性细胞后，细胞摄取葡萄糖的量增加，改善了细胞胰岛素抵抗。为探索细胞产生胰岛素抵抗以及抵抗改善时葡萄糖摄取能力改变的机理，我们采用RT一PCR和western blot技术，探讨胰岛素信号传递途径中哪些信号蛋白影响了细胞对葡萄糖的摄取，并对与胰岛素抵抗综合症相关的基因进行侧}究，结果如下:四川大学博士学位论文摘要地塞米松/胰岛素作用3T3一L1脂肪细胞后，显著降低了葡萄糖转运蛋白G加t4的，nRNA表达和蛋白水平。罗格列酮作用抗性细胞后，不仅捉高了Gl。t4的转录水平，而且增加了(il。科蛋白水平，从而改善了细胞摄取葡萄糖的能力。2.胰岛素受体底物工哪一1在胰岛素抵抗时，mRNA和蛋白水平明显降低;罗格列酮改善胰岛素抵抗后，11铭一1的ml丈NA和蛋白水平无显.著改变3.过氧化物酶体增殖物激活受体P以l之一Y是细胞核内一卜分重要的受体，‘列姨.岛索信号传递途径中多种信号蛋白的车专录有关。在胰岛素抵」九114l’I，AI又一Y的;。l州A和蛋白水平降低;罗格列酮改善细胞抗性后，n:l州A和蛋自水平有一所提高，但仍低于正常水平。d.〔:一(:l)}相关蛋自以l“处一J一二葡萄糖转运蛋自(il。t理转位调控的新信一号途径_上。rnl丈NA对该条信号途径的胰岛素信号传递起限速作用。在胰岛素抵抗时，C/尸水平并无明显变化，但在罗格列酮改善胰岛素抵抗时，C八P的nll之N八水，}乙则明显提}苛。5.纤溶酶原激活物抑制剂以I是心血管疾病发生的重要因素。在胰岛索低抗时，l)AI。飞RNA显著__!二调;罗格列酮改善细胞抗性时，以噢袱NA水平继续6.脂肪酸结合蛋白叩2在胰岛素抵抗时，其m议NA水平无明显变化;罗格列酮改善细胞抗性时，aPZm尺NA显著提高。土述结果揭示:地塞米松/)咦岛素可能通过降低PI”从一Y的转录和翻译，四川大学博士学位论文摘要减少P以l丈一Y蛋白，从而降低其下游基囚Gl叽4的llll{NA和蛋白水平，彩响葡萄糖转运蛋白的生成。胰岛素抵抗时胰岛素信一号传递的主要蛋自工}裕一1的m尺NA和蛋白水平均下一调，阻碍了胰岛素信号的传递。在罗格列酮作用抗性细胞后，PPAR一Y的ml{NA和蛋白水平上调，其下游基因Glut4的，nRNA和蛋白水平也丁十高，并使影响葡萄糖转运蛋白Gl、、t注转位的第二条信号途径关键蛋匕一{CAI”的转录增加，从而提高了Gl。t4的蛋白量和转位能力，细胞对葡萄糖的利川增加，改善了细胞胰岛素抵抗。纤溶酶原激活物抑制剂PAI在地塞米松诱导抵抗时并未改变其转录活性，但在地塞米松/胰岛素诱导抵抗以及胰岛素存在下罗格列酮改善细胞抗州时转录土调，揭示以1的增加一可能是高胰岛素作用的结果。因此，本实验的结果为地塞米松/胰岛素诱导的胰岛素抵抗模型发生机理的阐明提供了较