论文部分内容阅读
随着核能与核相关技术在工农业生产、医疗、军事等多个领域的广泛应用,由电离辐射（ionizing radiation,IR）引起的放射损伤也越发常见。骨髓（bone marrow,BM）对射线极度敏感,短时间内受照剂量超过1.0 Gy就足以产生明显的造血系统损伤。中高剂量的电离辐射还会严重扰乱造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）的稳态,导致其数量急剧减少,最终引起骨髓造血功能衰竭,但其中的机制仍未阐明,目前也无有效的救治措施。因此,进一步揭示骨髓造血干细胞稳态调节的关键因素,以及放射损伤后造血干细胞枯竭和造血功能衰竭的发生机理,对寻找新的救治策略以及研制相关新药具有重要的指导意义。成熟的血细胞寿命有限,必须由造血干细胞通过增殖、分化进行补充。造血干细胞具有自我更新和向各系造血细胞分化的能力。根据存活时间长短和自我更新能力强弱,造血干细胞又分为长期造血干细胞（long-term HSC,LT-HSC）、短期造血干细胞（short-term HSC,ST-HSC）和多能祖细胞（multipotent progenitor,MPP）。成体造血干细胞主要处在氧分压较低的骨髓龛（niche）中,其具有独特的代谢特点,即主要依赖无氧的糖酵解为其生命活动提供能量,有氧代谢则处于相对抑制的状态。而在各种应激（如辐照、感染和化疗）条件下,它原有的代谢模式会发生转变,逐渐向线粒体代谢倾斜,以满足能量增加的需求。在正常情况下,骨髓组织中的大部分造血干细胞都处于静止或者静息状态,尤其是LT-HSC基本上处于休眠状态,这是维持其稳态并防止电离辐射和细胞毒性物质损伤的关键。虽然在过去的50多年中,国内外的研究人员已经发现了多种关键的造血调节因子,但造血干细胞稳态的精确调控机制尚未完全阐明,亟待深入地探索和研究。类固醇受体活化辅激活因子3（steroid receptor coactivator 3,SRC-3）,是SRC家族（包括了SRC-1、SRC-2和SRC-3三个同源性蛋白）中的一个成员。作为核受体和其他转录因子的辅助活化因子,SRC-3可以招募转录所必需的组蛋白乙酰化酶以及其他一些转录共激活分子,调控靶基因的转录,从而在机体生长发育、性器官成熟、能量代谢等多个方面发挥着重要的生物学功能。由于SRC-3在多种肿瘤细胞（包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、白血病等）中高表达,因此之前的研究主要聚焦于它与肿瘤发生和发展之间的关系,而对它在造血系统中的作用知之甚少。但有文献报道,SRC-3敲除后小鼠外周血中白细胞显著增多,血小板显著减少。我们前期研究也发现,SRC-3基因敲除小鼠(SRC-3-/-)骨髓巨核细胞多倍体明显减少,并且其对辐照的敏感性明显增加,然而潜在的机制并不清楚,这种缺陷很可能来自于造血干/祖细胞层面。同时,我们也发现普通C57小鼠辐照后骨髓造血干细胞中SRC-3表达显著降低,提示SRC-3的下降很可能是辐照后造血干细胞稳态失衡的重要原因。最近还有研究指出,SRC-3是胚胎干细胞和肿瘤干细胞多能性网络的关键分子。据此,我们推测SRC-3可能对造血干细胞的稳态和功能具有潜在的调控作用。此外,以SRC-3为靶点,有望为骨髓放射损后造血干细胞稳态的失衡探寻新的救治方法。因此,本研究首先通过定量PCR、流式细胞术、免疫荧光和Western blot检测了SRC-3在小鼠骨髓造血干细胞中的表达水平;然后主要利用流式细胞术对野生型（wild-type,WT）和SRC-3-/-小鼠骨髓造血干细胞的比例、数量、细胞周期、增殖、凋亡、分化以及动员等情况进行了全面的对比和分析,以明确SRC-3对造血干细胞稳态的调控作用;在此基础上,我们利用小鼠急性放射损伤模型,观察了SRC-3对造血干细胞的辐射保护作用,并通过非竞争性骨髓移植、竞争性骨髓移植等实验研究了SRC-3缺失对造血干细胞长期造血重建能力的影响;最后,通过全转录组芯片、流式细胞术、免疫沉淀、Seahorse分析、慢病毒转染等技术对SRC-3调控造血干细胞稳态的机制进行深入的分析和探讨。主要研究结果及结论如下:1、定量PCR、流式细胞术、免疫荧光和Western blot结果显示,SRC-3在小鼠骨髓造血干细胞中的表达显著高于造血祖细胞以及分化成熟的细胞,这种特殊的表达模式提示SRC-3对造血干细胞可能具有潜在的调控作用。2、流式细胞术检测发现,SRC-3敲除后小鼠骨髓中造血干细胞的总数显著增加;在造血干细胞亚群中,LT-HSC的比例升高,MPP的比例降低,ST-HSC的比例没有显著变化;在造血祖细胞中,髓系共同祖细胞（common myeloid progenitor,CMP）的比例显著降低,但是粒单系祖细胞（granulocyte monocyte progenitor,GMP）、巨核系-红系祖细胞（megakaryocyte erythroid progenitor,MEP）和淋巴系共同祖细胞（common lymphoid progenitor,CLP）的比例并没有发生显著变化。这些结果表明SRC-3的存在有助于维持骨髓中造血干/祖细胞比例和数量的平衡。3、Ki67和Brd U染色结果显示,SRC-3敲除后小鼠骨髓造血干细胞的静止状态受到扰乱,导致其过度增殖和活化;另外,定量PCR结果也显示,SRC-3敲除后造血干细胞中细胞周期蛋白Cyclin E1和Cyclin E2显著上调,细胞周期抑制因子P21和P27显著下调。这表明SRC-3参与了造血干细胞静止状态的维持。4、SRC-3敲除后小鼠脾脏和外周血中造血干细胞的比例显著增加,说明SRC-3缺失促进了造血干细胞从骨髓向外周的动员。5、利用小鼠急性放射损伤模型,我们发现与野生型小鼠相比,SRC-3敲除小鼠在辐照之后骨髓造血干细胞的恢复明显减慢,DNA损伤和凋亡也显著增加,说明SRC-3对造血干细胞具有辐射保护作用;此外,SRC-3敲除也增加了造血干细胞对5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）的敏感性。这些可能是由于SRC-3敲除后造血干细胞失去静止、异常增殖所致。6、非竞争性骨髓移植、竞争性骨髓移植、反向骨髓移植等实验证实SRC-3缺失损伤了造血干细胞的长期造血重建能力,并且SRC-3主要是通过内在性的机制调控了造血干细胞的稳态。7、全转录组芯片提示,SRC-3敲除后小鼠骨髓造血干细胞中线粒体相关成分显著上调,氧化磷酸化通路显著活化;进一步的实验证实,SRC-3缺失增加造血干细胞中线粒体的数量、膜电位以及代谢活性。8、SRC-3敲除后小鼠骨髓造血干细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平显著增加,并且这些活性氧主要来源于线粒体,因此抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）的处理可部分逆转SRC-3缺乏后造血干细胞的异常表型和功能。9、SRC-3缺失导致造血干细胞中乙酰化酶GCN5的表达显著下调,从而降低了过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活蛋白1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivators 1α,PGC-1α）的乙酰化水平并导致其活化,最终促进了线粒体的能量代谢。因此通过慢病毒转染过表达GCN5可明显改善SRC-3缺失诱导的造血干细胞表型和功能的缺陷。总之,通过本研究,我们首次揭示了SRC-3是一个参与造血干细胞稳态调控的关键因子,同时明确了SRC-3对造血干细胞的辐射保护以及功能维持作用,也进一步阐明了SRC-3调节造血干细胞稳态和功能的分子机制,为放射损伤条件下造血干细胞稳态失衡的防治提供了一定的指导。