论文部分内容阅读
茄子黄萎病(Verticillium Wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)侵染引起的茄子重要病害之一。可造成茄子(Solanum melongemaL.)大幅度减产,对茄子生产的危害极大。目前,在普通栽培茄品种中缺少高抗种质,而其近缘野生种水茄(Solanum torvum)高抗黄萎病,是研究茄子抗黄萎病分子机制的重要试验材料。本研究根据野生茄水茄接种黄萎菌后的转录组测序结果,筛选出一个上调表达的WRKY转录因子基因StWRKY-1。通过荧光定量qRT-PCR对其表达进行研究,同时利用烟草瞬时侵染对其进行亚细胞定位分析和抗病鉴定。而且通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)及转基因拟南芥植株的抗病性鉴定,研究了StWRKY-1基因在黄萎病抗性中的作用。主要研究结果如下:1、从野生茄水茄中克隆出一个受黄萎病诱导表达的WRKY转录因子基因,并命名为StWRKY-1。该基因编码区为1650bp,编码550个氨基酸。将StWRKY-1蛋白序列与其他物种WRKY蛋白序列进行比对,并构建系统进化树后发现其与辣椒的CaWRKY6和CaWRKY1同源性较高。通过荧光定量qRT-PCR分析StWRKY-1在水茄中的表达模式,发现StWRKY-1在根中表达量较高,在叶中表达量较低;在接种黄萎病菌24 h表达量最高。构建亚细胞定位载体,瞬时侵染本氏烟,通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布情况,结果发现,该基因行使功能的主要区域定位在细胞核。2、通过构建StWRKY-1的VIGS沉默载体,将水茄的内源StWRKY-1基因沉默。利用qRT-PCR进行沉默效果分析,表明该基因表达量下降。对沉默植株的抗病性鉴定表明,接种黄萎病菌20 d后,沉默植株的黄萎病菌的量约为对照的3倍,同时,叶片出现扭曲、皱缩等表型。进一步在本氏烟中瞬时表达StWRKY-1基因,接种烟草疫霉病菌后发现StWRKY-1瞬时表达后的烟草叶片病斑面积为1.13 cm2,而对照组为3.14 cm2;而且StWRKY-1可以通过调控植物激素通路防卫反应基因的表达来增强植物的抗病性。将StWRKY-1转入野生型拟南芥中,经过筛选及鉴定最终获得T3代拟南芥转基因株系,以此为试验材料对其功能进行了初步研究。在接种茄子黄萎病菌后,转基因拟南芥植株生长无明显变化,而野生拟南芥虽无明显的黄化萎蔫现象,但是其生长受阻或生长迟缓,比同期转基因拟南芥矮小。上述结果表明,水茄的StWRKY-1基因对茄子黄萎病具有抗性,并同时对烟草疫霉具有抗性,可应用于抗病新种质创制。