口腔粘膜的鳞状细胞癌是最常见的口腔恶性肿瘤,是全球十大高发癌症之一。近年来,口腔癌的发病率有逐年增高和年轻化的趋势。其中舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一,且恶性程度高,转移率大,占人类恶性肿瘤死亡率的1%左右,其治疗后的5年生存率约为30%-50%。肿瘤的复发、转移是影响肿瘤患者预后不良的主要因素,因此对肿瘤侵袭转移机制的研究将会为肿瘤的治疗及肿瘤患者预后的改善提供重要的线索。研究表明在影响肿瘤侵袭转移诸多因素中,细胞骨架的改变在肿瘤细胞转移过程中发挥重要作用,其中构成细胞骨架主要成分之一的微管的减少及解聚与恶性肿瘤的转移潜能有关。微管(microtubule,MT)是细胞骨架的主要成分之一,构成细胞的网状支架,维持细胞形态；参与细胞内物质运输、细胞的收缩与伪足运动及细胞器的位移,尤其是染色体的分裂和位移,需要在微管的帮助下进行。微管还与有丝分裂和减数分裂等生命活动密切相关。大多数微管处于动态的聚合和解聚及之间的随机转换状态。在微管解聚和聚合过程中,驱动蛋白发挥重要作用。驱动蛋白(Kinesin)是真核细胞中一类保守的具有ATP酶活性的微管马达蛋白。它们可利用水解ATP产生的能量沿微管运动,参与细胞内多种重要的生命活动,包括膜性细胞器、蛋白质、mRNA的运输等。Kinesin-13是驱动蛋白家族中的一类特殊的蛋白质,具有解聚微管的作用,在哺乳动物中可以分为3个亚家族：Kif2a、Kif2b和Kif2c。研究显示,Kif2a定位于中心体,因此可能参与中心体的移动过程。Homma等采用启动子捕获策略(promoter trap strategy)建立Kif2a敲除小鼠模型,通过迁移率统计分析显示,与对照组相比,Kif2a敲除组小鼠出现大脑神经元迁移延迟、脑组织板层缺失及神经核定位错误等现象,提示Kif2a缺失可影响神经元的迁移能力。由此可以推测Kif2a缺失可能通过改变神经元胞体的微管动力学,而最终导致了神经元迁移缺陷。在细胞有丝分裂期,Kif2a主要定位于纺锤体极并参与细胞内双极纺锤体的组装及姐妹染色体的分离；Neil.J Ganem、Zhu等采用RNAi技术分别沉默人U2OS细胞及HeLa细胞中的Kif2a基因,导致细胞有丝分裂期单极纺锤体形成,从而证实Kif2a对细胞双极纺锤体的形成是必需的。同样,Jedidiah Gaetz等将Kif2a单克隆抗体加入蟾蜍卵细胞中,结果出现微管束延长的单极纺锤体。基于此,我们可以推测阻断Kif2a的表达有助于阻止恶性肿瘤细胞内纺锤体的正常形成,使染色体不能正常地分离,从而抑制增殖旺盛的恶性肿瘤细胞。鉴于以往研究显示的Kif2a在细胞分裂过程中纺锤体形成及细胞运动过程中骨架的改变中的重要作用,我们推测其在恶性肿瘤中可能存在异常表达并与肿瘤细胞侵袭迁移存在相关性。而目前,关于Kif2a在恶性肿瘤中的表达及其与肿瘤的侵袭转移、预后的关系的研究尚未见报道。为了明确Kif2a在舌鳞状细胞癌中的表达,本实验从蛋白水平检测舌鳞状细胞癌组织中Kif2a的表达并探讨其临床意义。应用针对Kif2a的siRNA质粒沉默舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞中Kif2a的表达,研究Kif2a基因对细胞增殖、凋亡及侵袭迁移能力的影响。此外,我们还通过基因芯片技术研究了Kif2a基因沉默后Tca8113细胞全基因组表达谱的变化,从中找到差异显著的基因并加以验证,分析Kif2a基因沉默抑制舌癌生长转移的分子机制,以探讨其作为舌癌生物和基因治疗潜在分子靶点的可能,为舌癌治疗提供新的有效的治疗策略。第一部分Kif2a在舌鳞状细胞癌中的表达及意义目的研究微管解聚蛋白Kif2a在舌鳞状细胞癌中的表达及意义。方法1.标本收集：收集2005-2008年山东大学口腔医院44例舌鳞状细胞癌住院患者的肿瘤标本。患者按照年龄、性别、肿瘤临床分期、肿瘤分化程度、肿瘤有无淋巴转移分类。诊断标准参考《头颈部肿瘤病理和遗传学》(世界卫生组织分类及诊断标准)。所有患者术前均未行放疗、化疗以及其它干预治疗,并同期行颈部淋巴结清扫术。2.应用免疫组化方法检测Kif2a蛋白在舌鳞状细胞癌、配对癌旁组织及淋巴结转移灶中的表达定位,并对免疫组化结果进行评分分析,评价Kif2a蛋白的表达与临床资料之间的关系。结果免疫组化结果显示,44例舌癌原发灶与配对癌旁组织均见Kif2a阳性表达；其中与配对癌旁组织相比,70.5%(31/44)的舌癌原发灶高表达Kif2a(P=0.002)。Kif2a蛋白主要表达在细胞质及胞核,呈棕黄色颗粒,在舌癌细胞胞浆中染色较强、棕黄色颗粒较粗大,而在癌旁组织细胞中染色较弱、黄色颗粒小；与配对舌癌原发灶相比,70%(14/20)淋巴结内转移灶癌细胞高表达Kif2a (P=0.001)。Kif2a阳性表达主要定位于癌细胞胞浆及胞核内,呈深棕黄色、粗大颗粒。此外,Kif2a的表达在Ⅲ/Ⅳ期肿瘤细胞高于Ⅰ/Ⅱ期肿瘤细胞(P=0.001)；在有淋巴结转移的原发灶癌细胞高于无淋巴结转移的原发灶癌细胞(P=0.038)。Kif2a的表达与病人性别、年龄、肿瘤分级及组织学类型均无关。结论Kif2a在舌鳞状细胞癌中的存在异常表达,在癌旁组织弱表达；在淋巴结转移灶癌细胞中的表达明显强于原发灶癌细胞。Kif2a的表达水平与肿瘤的临床分期、淋巴结转移有关。Kif2a可作为评价舌鳞状细胞癌预后的一个重要因子。第二部分Kif2a基因沉默对Tca8113细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响目的1.探讨siRNA介导的Kif2a基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞增殖、凋亡及侵袭迁移能力的影响。2.观察化疗药物5-氟尿啶(5-Fu)与Kif2a基因沉默对Tca8113细胞增殖的共同作用。3.观察Kif2a基因沉默对裸鼠舌癌移植瘤生长情况的影响。方法1.细胞培养：舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞在37℃,5%CO2饱和湿度条件下,培养于含10%胎牛血清,l00IU青霉素、100g/ml链霉素的DMEM培养液中。2. pGPU6/GFP/Neo-Kif2a质粒及pGPU6/GFP/Neo-NC质粒的构建：于文献资料中检索到Kif2a的siRNA序列。靶序列为5’-GGCAAAGAGAUUGACCUGG-3’将此片段设计为shRNA,并克隆入pGPU6/GFP/Neo载体(含有编码绿色荧光蛋白GFP的基因),命名为pGPU6/GFP/Neo-Kif2a。阴性对照靶序列为5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3’,将此片段设计为shRNA,并克隆入pGPU6/GFP/Neo载体,命名为pGPU6/GFP/Neo-NC。siRNA质粒构建及重组质粒序列测定由上海吉玛公司完成。3. pGPU6/GFP/Neo-Kif2a基因干扰效率的检测：将对数生长期的Tca8113细胞以2×105数目接种于6孔培养板中。当细胞融合率达到70%左右,用脂质体liPofectamine2000转染细胞。将细胞分为实验组、阴性对照组、空白对照组,分别转染pGPU6/GFP/Neo-Kif2a、pGPU6/GFP/Neo-NC及空脂质体。转染后48h,收集细胞,提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法检测不同实验组中Kif2a的基因表达。转染后72h,收集细胞,提取细胞总蛋白,应用Western-blot方法检测不同实验组中Kif2a的蛋白表达。分析三个不同实验组中Tca8113细胞Kif2a的基因、蛋白表达情况。评价pGPU6/GFP/Neo-Kif2a基因干扰效率。4.重组质粒稳定转染舌鳞癌细胞系的建立及其鉴定：经脂质体介导分别将pGPU6/GFP/Neo-Kif2a、pGPU6/GFP/Neo-NC转染Tca8113细胞,经G418稳定筛选,建立稳定敲除Kif2a基因的细胞模型。转染pGPU6/GFP/Neo-Kif2a的阳性克隆命名为Kif2a干扰组(Tca8113-Kif2a),转染pGPU6/GFP/Neo-NC的阳性克隆命名为NC对照组(Tca8113-NC)。采用荧光显微镜观察绿色荧光判定质粒转染效率,通过Weatern blot方法检测上述各组细胞中Kif2a的表达情况,鉴定Kif2a稳定敲除的细胞模型。5.MTT法检测Kif2a基因沉默对Tca8113细胞增殖的影响：取指数生长期Tca8113-Kif2a、Tca8113-NC及Tca8113细胞消化计数后按5×103个/孔接种于96孔细胞培养板中,培养9天,于第1、3、5、7、9天采用MTT方法检测各组细胞增殖情况。6. MTT法检测5-Fu与Kif2a基因沉默对Tca8113细胞增殖活性的共同影响：取指数生长期Tca8113-Kif2a、Tca8113-NC及Tca8113细胞消化计数后按5×103个/孔接种于96孔细胞培养板中,待细胞贴壁后,加入不同浓度5-Fu,培养4天后采用MTT方法检测各组细胞增殖情况。7.克隆形成实验检测Kif2a基因沉默后Tca8113细胞克隆形成能力：20%胎牛血清DMEM培养液与1.2%的低熔点琼脂糖混合作底层琼脂,各组1×105个细胞与0.6%的琼脂糖混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,形成双琼脂层。置入37℃5%CO2温箱中培养14天,在倒置显微镜下,观察细胞克隆数。计算形成率。8.流式细胞仪检测Kif2a基因沉默对Tca8113细胞凋亡率的影响：取各组细胞消化计数后按2×105/孔接种于6孔板中,待细胞融合至约80%,收集细胞,AnnexinV/PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。9.Transwell小室方法观察Kif2a基因沉默对Tca8113细胞侵袭迁移能力的影响：取各组无血清Tca8113细胞悬液100μl(1×105个细胞)加入小室的上室,下室加入600μl含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养20h。光镜下计数侵袭到滤膜背面的穿膜细胞数,评价细胞的侵袭能力。10.裸鼠背部舌癌肿瘤模型的建立及其生长情况：调整各组细胞悬液浓度为2×106个/ml备用。4周龄的BALB/c nu/nu雄性裸鼠共15只,随机分成干扰组(Tca8113-Kif2a)、阴性对照组(Tca8113-NC)、空白对照组(Tca113)3个组(每组5只)。乙醚吸入麻醉后,将以上3组Tca8113细胞悬液100μl分别注射于对应3个组裸鼠的背部皮下。每天观察肿瘤生长情况,每4天用游标卡尺测量一次肿瘤直径,计算肿瘤体积并绘制肿瘤的生长曲线。接种35天后脱颈处死三组裸鼠,剥离肿瘤,测量瘤体积、称量瘤重。结果1. pGPU6/GFP/Neo-Kif2a能够有效下调Kif2a的表达：质粒转染后48h,干扰组Tca8113细胞Kif2a mRNA的表达均较阴性对照组下降90%,转染后72h,干扰组Tca8113细胞Kif2a蛋白表达亦显著下调(P<0.05)2.pGPU6/GFP/Neo-NC及pGPU6/GFP/Neo-Kif2a中含有编码绿色荧光蛋白GFP的基因,稳筛成功的细胞在荧光显微镜下观察可发出绿色荧光。Western Blot检测结果显示,与对照组Tca8113-NC相比,Tca8113-Kif2a组细胞Kif2a的蛋白表达下调76.5%。3.应用MTT法检测Kif2a基因沉默后Tca8113细胞增殖活性,结果发现种板后第1、2天,三组Tca8113细胞的增殖活性未见明显差异,第3天开始,干扰组细胞的增殖活性与阴性对照组相比出现降低,统计学上有显著性差异(第3、5、7、9天P=0.013,0.015,0.017,0.005)；4. 5-Fu作用4天后,MTT法检测各组细胞的增殖情况,结果显示,与对照组相比,Tca8113-Kif2a细胞增殖活性显著下降,5-Fu的半数抑制率IC50显著降低(Tca8113-NC vs Tca8113-Kif2a:32.55±2.54vsl4.75±2.36,P=0.024), Kif2a基因沉默能显著增强5-Fu对Tca8113细胞的增殖抑制效应,增加Tca8113细胞对5-Fu的药物敏感性。5.克隆形成实验结果显示,与对照组Tca8113-NC相比,Tca8113-Kif2a组细胞克隆形成数目明显减少(281±17 vs 143±12,P<0.01)。6.流式细胞术结果显示,Tca8113-Kif2a细胞凋亡率为28.94%,与阴性对照组比较有显著性差异((28.94±3.739)%vs(6.617±1.263)%：P=0.014)。7. Transwell实验结果发现,与阴性对照组相比干扰组穿过滤膜的Tca8113细胞数量明显减少(1386±184.45 vs 646±55.00,P=0.014),而阴性对照组与空白对照组相比无明显差异。8.三组肿瘤细胞注射裸鼠背部皮下后,在局部形成水肿,4天后即可触及肿瘤硬结。肿瘤持续生长,开始呈圆形或者椭圆形,后来可呈结节状。空白组与阴性对照组肿瘤体积无明显差异,但Tca8113-Kif2a组生长相对较慢,12天后各组裸鼠移植瘤的体积出现差异,35天处死裸鼠,Tca8113-Kif2a肿瘤体积、重量均明显小于Tca8113-NC组(1505±391.5vs 2816±396.3 mm3,P<0.05;1.085±0.149 vs 2.979±0.532g, P<0.05)。结论1.pGPU6/GFP/Neo-Kif2a能够有效地抑制Tca8113细胞中Kif2a的表达,Kif2a基因沉默后Tca8113细胞增殖、凋亡及侵袭能力明显降低；Kif2a基因沉默能够抑制裸鼠移植瘤的生长。2.Kif2a基因沉默能显著增加化疗药物5-Fu对细胞增殖的抑制效应,提高Tca8113细胞对药物的敏感性,为舌癌化疗提供了新的思路。3. Kif2a是基因治疗舌鳞状细胞癌的理想靶基因。第三部分Kif2a基因沉默对Tca8113细胞全基因组表达谱变化的影响目的1.分析Kif2a基因沉默对Tca8113细胞全基因组表达谱变化的影响,筛选与Kif2a信号通路有关的差异基因,以便更好地认识Kif2a信号通路的传导过程及其在舌癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移调控中的作用机制。2.探讨Kif2a基因作为靶基因抑制舌鳞状细胞癌生长、侵袭及转移的分子机制。方法1、基因芯片技术研究Kif2a基因沉默对Tca8113细胞全基因组表达谱变化的影响：收集对数生长期各组细胞5×106个,加Trizol提取总RNA,进行基因芯片分析(上海康成生物有限公司)。使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度。采用LuxScan 3.0图像分析软件(CaPitalBio公司)对芯片图像进行分析处理,荧光染料cy3的信号用绿色表示,cy5的信号用红色表示。整合两张芯片荧光强度的比值,即Ratio值,以整合后的Ratio值≥2.0或≤0.5为标准确定差异表达基因,其中Ratio值≥2表示基因表达上调,Ratio值≤0.5表示基因表达下调。2.差异表达基因的通路分析及差异表达基因的验证：利用Biorag数据库基因通路分析工具,对差异表达基因进行分析。并应用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)技术对其中几个重要的差异表达基因进行验证。实验数据经看家基因归一化后,将通过real time RT-PCR检测得到的差异表达基因的Ratio值与芯片检测得到的Ratio值进行比较,以评价芯片检测结果的可靠程度。结果1.基因芯片扫描结果显示信号清晰,富有层次,且背景均匀：黄色为Tca8113-Kif2a和Tca8113-NC两种细胞共同表达的基因,红色为Tca8113-Kif2a细胞过表达的基因,绿色为Tca8113-NC细胞过表达的基因,重复实验效果良好。2.基因表达谱分析比较,Tca8113-Kif2a与Tca8113-NC之间共有2093个存在显著差异表达的基因。其中在干扰组明显上调的基因主要包括细胞因子/趋化因子及其受体类9个,细胞骨架/ECM调节因子类9个,脂质代谢类类5个,细胞表面分子/受体类3个,转录因子类10个及其他类12个；明显下调的基因主要包括细胞因子/趋化因子及其受体类2个,细胞骨架/ECM调节因子类4个,脂质代谢类类2个,细胞表面分子/受体类4个,转录因子类3个及其他类3个。3.差异表达基因的通路分析结果显示差异表达的基因涉及多个通路,主要包括细胞周期/有丝分裂、细胞凋亡以及PI3K/Akt信号转导通路。4. Real time RT-PCR验证结果显示,PI3K、Akt、Bcl-2,Bax和MMP-9基因的Ratio值与芯片检测得到的Ratio值接近,证实本研究中基因芯片检测得到的结果能较好地反映基因差异表达的趋势,结果较可靠。结论1. Kif2a基因沉默可导致Tca8113细胞全基因组中部分基因的变化,并涉及多个与细胞增殖、凋亡及迁移密切相关的信号转导通路2. Kif2a可通过PI3K/Akt信号转导通路调控细胞的增殖、凋亡及侵袭迁移。