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羊口疮病毒（orf virus,ORFV）又称接触传染性脓疱性口炎（contagious secthyma）病毒,属于痘病毒科副痘病毒属,主要可感染绵羊和山羊,可引起羔羊的口唇黏膜和肛门部位形成水疱、脓疱和痂皮等,发病率高死亡率高。2016年12月,安徽肥西某羊场暴发疑似羊口疮（Orf）疫情,采集羊病料后,利用原代绵羊睾丸细胞（Ovis aries testis cell）对其进行病毒的分离增殖培养,并对病毒的增殖特性进行初步鉴定。此外,对20132017年间流行于安徽省的10株羊口疮病毒的部分功能基因进行了序列分析。为了建立可稳定增殖羊口疮病毒的传代细胞系,利用慢病毒包装系统将人端粒酶逆转录酶亚基（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）整合入绵羊睾丸原代细胞的染色体中,借助于嘌呤霉素的压力,成功筛选出永生化的绵羊睾丸细胞系,为后续羊口疮病毒的研究奠定了基础。具体内容如下所示。1、羊口疮病毒AH-FX16株的分离鉴定及生物学特性研究:首先,分离和鉴定了一株羊口疮病毒,该发病羔羊出现口腔黏膜、舌头、嘴和唇的周围皮肤出现红疹、水疱、脓疱及结痂等典型的Orf发病特征。采集发病羊的水疱皮,提取组织总DNA,用PCR方法特异性地扩增出ORFV的VIR基因。将过滤除菌后的病料接种于绵羊原代睾丸细胞,48h后可观察到明显细胞病变,如出现细胞脱落,细胞间距拉大等现象。培养至第5代的ORFV的滴度TCID50为10-4.625/0.1mL。间接免疫荧光检测结果显示,ORFV主要分布在细胞核,少量病毒在细胞质中出现。Western-Blot检测结果进一步证实,细胞培养物中存在ORFV的特异性蛋白（B2L蛋白）。将纯化后的病毒在电镜下观察,可看到到典型的羊口疮病毒粒子,呈椭圆形,毛线球样,有囊膜,直径为200300nm。最后,将分离到的ORFV经皮肤划痕接种一月龄羔羊,结果羔羊出现典型的羊口疮发临床症状。上述结果证明,我们成功分离到了具有感染性的羊口疮病毒,将其命名为AH-FX16株。2、2013年2017年安徽地区羊口疮病毒的部分功能基因序列分析:本论文对本实验室保存的2013年2017年间,流行于安徽省的羊口疮病毒的11个基因（ORF007、ORF008、ORF011、ORF020、ORF059、ORF112、ORF117、ORF125、ORF129、ORF132）进行了扩增和序列比对分析。结果发现这些流行毒株的基因间存在着“普遍”的碱基插入或缺失现象,提示ORFV是在不断的进化过程中,但进化相对稳定。遗传进化树结果显示,安徽流行的ORFV毒株形成一个大的进化群,与流行于福建的毒株具有很近的亲缘关系。3、利用慢病毒包装系统构建永生化绵羊睾丸细胞系Ov-ST:首先构建了重组质粒pLOV-CMV-hTERT,然后将重组慢病毒载体三质粒系统共转染293T细胞包装重组病毒颗粒,慢病毒颗粒感染原代绵羊睾丸原代细胞,经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆,分别应用RT-PCR和Western blot方法检测传代细胞系中hTERT基因的转录和表达水平。筛选获得的阳性克隆,命名为Ov-ST。将阳性细胞克隆连续传代20次以后,细胞形态稳定,分裂和生长能力良好。最后分别取10代和20代永生化细胞,用RT-PCR,IFA及Western blot检测其中端粒酶的表达,结果表明hTERT在所有细胞中都能稳定表达。用ORFV AH-FX16分离株接种OV-ST细胞,ORFV可以稳定增殖。永生化绵羊睾丸细胞系Ov-ST的成功构建,为羊口疮疫苗的研制和羊口疮病毒感染机制的研究奠定了基础。