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流行性感冒是由流感病毒引起的一种人畜共患急性呼吸道传染病。20世纪流感的大流行,造成了千百万人的死亡,而近年来流感爆发更为频繁。2003年底爆发的高致病性禽流感给世界养禽业造成巨创,并造成数百人死亡;2009年爆发的甲型H1N1流感,在短时间内扩散到全球199个国家,并导致逾万人死亡。尽管人类对流感和禽流感的认识已有近百年历史,但现有防治高致病性流感的医疗技术仍十分薄弱。流感疫苗在防治流感疾病中起到重要的作用,但只局限于对某个季节或可预知的流感病毒株起作用。目前防治流感药物主要有两种:M2蛋白离子通道抑制剂如金刚烷胺、金刚乙胺;神经氨酸酶抑制剂如扎那米韦、奥司米韦。金刚烷胺已表现出严重的耐药性和副作用;神经氨酸酶抑制对普通流感起到很好的防治效果,但对高致病性流感的作用却遭到质疑。因此,寻找新型安全高效的抗流感病毒药物,对防治流感有十分重要的意义。
茶多酚是茶叶中的主要活性成分,具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血糖等多种活性,但茶多酚抗流感病毒活性方面的研究报道较少。本论文通过细胞感染试验、血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验系统地评价了没食子儿茶素(GC)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、原儿茶醛(PAD)、原儿茶酸(PA)七种茶多酚体外对流感病毒的抑制作用,探究其可能的作用机制。本论文还研究了主要成分为茶多酚的苦茶提取物对感染流感病毒小鼠的肺炎抑制作用,评价茶多酚动物体内的抗流感效果。
细胞感染试验:药物与病毒同时加入MDCK细胞中,考察同时给药方式茶多酚对流感病毒的抑制作用。结果表明,EGCG、ECG对感染H1N1、H9N2和H5N1三种亚型流感病毒的MDCK细胞均有极显著保护作用(P<0.01),EGCG最高保护率分别为80.11%、92.40%、64.44%,ECG最高保护率分别为87.85%、82.34%、77.53%,均高于对照药物利巴韦林。进一步考察了预防给药(先加药后接种病毒)、治疗给药(先感染病毒后加药)和同时给药(感染病毒同时加药)三种作用方式下,EGCG对感染H9N2亚型流感病毒MDCK细胞的保护作用。结果表明,EGCG在同时给药、预防给药方式中效果较好,最高保护率分别为66.09%、50.94%,均优于对照药物利巴韦林。
血凝抑制试验:通过考察茶多酚对流感病毒表面的重要抗原-血凝素(HA)的抑制作用,从而确定HA是否是茶多酚抑制病毒的作用靶点。结果表明,PA能明显抑制H1N1、H9N2,H5N1三种亚型流感病毒对鸡红细胞的血凝作用,MIC值均为0.058 mM,EC、PAD也显示明显的抑制作用,但EGCG、ECG、EGC和GC的血凝抑制作用不明显。
神经氨酸酶(NA)抑制试验:通过茶多酚对流感病毒表面的重要抗原-神经氨酸酶(NA)的抑制作用,从而确定NA是否是茶多酚抑制病毒的作用靶点。结果显示,七种茶多酚均能抑制流感病毒NA活性,其中EGCG、PAD、ECG对三种亚型流感病毒NA活性显示出很强的抑制作用,EGCG对H1N1、H9N2,H5N1三种病毒NA的抑制率分别为81.43%、95.15%和89.46%;PAD对H1N1、H9N2,H5N1三种病毒NA的抑制率分别为96.06%、94.65%和93.86%;ECG对H1N1、H9N2,H5N1三种病毒NA的抑制率分别为72.35%、82.35%和85.65%;茶多酚对H1N1、H9N2、H5N1三种病毒NA的抑制作用存在浓度依赖性。
小鼠感染试验:利用H9N2亚型流感病毒感染小鼠模型,研究了茶多酚含量为85%的苦茶提取物对感染流感病毒小鼠的肺炎抑制效果,结果显示1000 mg/kg/d苦茶提取物对感染H9N2亚型流感病毒BALB/c鼠肺炎有显著抑制作用(P<0.05),肺指数抑制率达37%,与利巴韦林组接近(46%)。
由上述各试验结果可得出,茶多酚对感染流感病毒MDCK细胞和小鼠均有显著保护作用。茶多酚对流感病毒神经氨酸酶显示出显著的抑制作用,这可能是其抗病毒的作用机制。初步确定EGCG和ECG是苦茶提取物抗流感的主要药效成分。