研究背景：　　尿酸是人类嘌呤代谢的终产物，高尿酸血症是由于体内嘌呤代谢紊乱致使血尿酸生成过多或排泄减少，以及外源性嘌呤摄入过多引起血尿酸水平升高，造成高尿酸血症或尿酸性肾结石。从欧美发达国家的流行病学数据看，尿酸结石及高尿酸血症的患病率随着国家经济水平的提高而增加，近年来，随着经济发展和膳食结构的改变，痛风和高尿酸血症的发病率呈上升趋势，已成为继糖尿病之后的第二大代谢类疾病。高尿酸血症与高血压、血脂异常、高血糖、肥胖等疾病密切相关，也是心血管疾病的独立危险因素，近些年的研究提示，高尿酸血症与肾功能进展密切相关，高尿酸血症通过影响肾小管上皮细胞功能紊乱从而导致高血压和肾间质损害，最终形成恶性循环导致肾功能衰竭。高尿酸血症肾病以严重的肾间质纤维化和小管上皮细胞萎缩、脱落、再生障碍为特征。研究表明，肾间质成纤维细胞以及浸润的单核细胞在间质纤维化中起重要作用，其中部分成纤维细胞来源于转分化的小管上皮细胞。然而该机制并不仅仅是高尿酸血症或尿酸类结晶引起肾间质纤维化唯一途径，其具体机制仍不甚清楚。　　上皮细胞紧密连接（Tight Junction，TJ）是上皮细胞连接复合体的一部分，是由多种蛋白质共同构成的结构复杂，功能多样的蛋白复合体。TJ不仅能够封闭细胞间隙，参与构成屏障系统，而且还与细胞内信号传导的生长分化密切相关，随着研究的深入，发现TJ还具有很多别的功能。如：TJs(Tight Junction proteins，TJs)阻止蛋白和脂质在质膜顶端和底端之间的自由扩散，起到了保护细胞极性的　　作用;TJs具有特定的阀门功能，可以调整水、分子和离子的细胞间通路；构成TJs的蛋白质参与细胞的信号传导；还可以往返于细胞核与TJs之间，并且能够与特异的转录因子结合，参与基因的表达与调控。有研究提示，很多病理、理化因素均可以影响 TJs蛋白的表达，使其发生改变。TJs蛋白主要包括跨膜蛋白Occludin，claudins，JAMs，胞质附着蛋白ZO家族(zonula occludens protein)及与其相连的细胞骨架蛋白。其中以Occludin与ZO-1最为重要。Occludin与ZO-1相互作用后，将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起，并调节细胞内外信号转导途径，改变肌动蛋白收缩性，影响细胞间紧密连接装配与功能，调节其通透性。Occludin及ZO-1的表达和分布与慢性肾脏疾病（Chronic kidney disease，CKD）特别是肾小管上皮细胞转分化（epithelial-mesenchymal-transdifferentiation，EMT）密切相关。最新的研究发现，草酸钙结晶培养液刺激下可以引起肾小管上皮细胞 TJ蛋白的重新分布，并且表达下调，肾小管上皮细胞交界暴露于草酸钙晶体液，可能引起随后的肾小管间质损伤甚至间质纤维化。而高尿酸血症或尿酸性肾结石诱导肾脏间质纤维化过程中是否同样引起紧密连接蛋白表达的改变，目前研究报道甚少，所以我们在本课题的研究中，选择以 Occludin，ZO-1作为研究对象，研究其在高尿酸血症诱导大鼠肾间质纤维化肾组织中的表达，并应用降尿酸药物—别嘌呤醇观察其干预作用。　　研究目的：　　本实验通过RT-PCR和免疫组织化学染色方法检测，观察Occludin及ZO-1在肾间质纤维化肾组织中的表达，取正常大鼠肾组织作为阳性对照组。研究Occludin及ZO-1在高尿酸酸血症诱导大鼠肾间质纤维化肾组织中的表达和分布情况，探讨未来寻找肾间质纤维化发生、发展中的治疗靶点，为CKD进行性发生、发展的防治提供重要的理论依据和新的思路。　　方法：　　1.建立高尿酸血症大鼠模型:将30只健康雄性SD大鼠随机分成3组，分别为正常对照组、高尿酸血症模型组、别嘌呤醇干预组，每组10只，饲养于 SPF级的实验室。模型组和干预组以2％的氧嗪酸混悬液按250mg/100g.次.每日3次灌胃，同时给予0.1mmol/l尿酸每日饮水，持续6周制备成高尿酸血症肾间质纤维化大鼠模型[1]。　　2.实用代谢笼收集大鼠24小时尿液，隔日无菌取血。分析大鼠24h尿量及尿蛋白定量、血尿酸、血肌酐和血尿素氮。　　3.处死大鼠，无菌取大鼠两侧肾脏。　　4.用一侧肾脏做成石蜡切片，进行HE染色、Masson染色，通过光镜观察检测切片中有无结石结晶、间质有无胶原纤维表达存在来判断造模是否成功。　　5.另取切片进行免疫组织化学染色，从蛋白水平分析 TGF-β1、α-SMA、E-Cadherin蛋白在高尿酸血症诱导下肾间质纤维化模型大鼠肾组织中的表达。　　6.使用另一侧肾脏分离出肾皮质，提取总RNA，逆转录为cDNA，采用标准曲线法进行实时荧光定量PCR反应，从基因水平分析ZO-1、Occludin mRNA在高尿酸血症诱导下肾间质纤维化模型大鼠肾中的表达。　　7.统计分析实验数据。　　研究结果：　　①．一般资料：喂养6周后，三组大鼠均存活。2%氧嗪酸联合0.1mmol/l尿酸诱导的大鼠2周时血尿酸水平显著升高，且维持在较高水平，形成持续稳定的高尿酸血症动物模型，尿量明显升高，肾功能损害，别嘌呤醇能明显降低尿酸水平。　　②．高尿酸血症能明显损害肾脏功能和结构，24h尿量、24h尿蛋白、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）明显升高，肾小球和肾小管间质明显病变；别嘌呤醇能减少尿量、尿蛋白排泄，降低UA、BUN、Cr水平，减轻肾小球和肾小管间质病变程度，延缓肾功能损伤的进程。　　③． Masson染色：光镜下观察正常组大鼠肾脏组织肾小管、肾小球大小、形态正常，未见肾小管间质炎性细胞浸润及纤维化等病理改变。高尿酸血症大鼠造模6周，肾小球代偿性肥大，部分毛细血管开放不良，肾小管扩张，部分小管上皮细胞脱落，上皮细胞呈空泡样变性，间质可见大量炎性细胞浸润间质增宽，并可见大量纤维组织增生。与高尿酸血症模型组相比，别嘌呤醇干预组大鼠肾组织炎症明显减轻，肾小管扩张程度较轻，肾小球及肾小管病变较轻，间质纤维化程度较轻。　　④． HE染色结果：偏光显微镜下观察肾组织病理切片，正常组大鼠肾脏病理切片不能观察到结石结晶，高尿酸血症模型组大鼠肾脏病理切片在肾组织内观察到大量黄褐色腺嘌呤代谢物结晶沉积，别嘌呤醇干预组大鼠肾脏病理切片在肾组织内观察到黄褐色腺嘌呤代谢物结晶沉积，但较高尿酸血症组明显减少。　　⑤．肾皮质ZO-1 mRNA的表达情况，结果显示：实验6周时与正常组织比较，高尿酸模型组和别嘌呤醇干预组 ZO-1 mRNA表达明显降低（p<0.05）,别嘌呤醇干预组ZO-1 mRNA表达较高尿酸血症模型组增加（p<0.05）；肾皮质Occludin mRNA的表达情况，实验6周时与正常组织比较，高尿酸模型组和别嘌呤醇干预组Occludin mRNA表达明显降低（p<0.05）,别嘌呤醇干预组Occludin mRNA表达较高尿酸血症模型组增加（p<0.05）；　　⑥．免疫组织化学染色α-SMA表达结果：实验6周结果显示，正常大鼠肾组织肾小管间质仅表达少量α-SMA蛋白。与正常组相比，高尿酸血症模型组与别嘌呤醇干预组大鼠肾脏组织α-SMA蛋白表达量均明显增高，且具有显著性意义（P<0.05）。与高尿酸血症模型组比较，别嘌呤醇干预组大鼠肾脏组织α-SMA蛋白表达量显著降低（P<0.05）。　　⑦．免疫组织化学染色TGF-β1表达结果：实验6周结果显示，正常组大鼠肾脏组织TGF-β1少量表达于肾小管，与正常组相比，高尿酸血症模型组与别嘌呤醇干预组大鼠肾脏组织TGF-β1蛋白表达量均明显增高，且具有显著性意义（P<0.05）。与高尿酸血症模型组比较，别嘌呤醇干预组大鼠肾脏组织TGF-β1蛋白表达量显著降低（P<0.05）。　　⑧．免疫组织化学染色E-cadherin表达结果：实验6周时，正常组大鼠肾脏组织 E-cadherin大量表达于肾小管上皮细胞间，阳性颗粒主要位于小管上皮细胞的基底膜区。模型组大鼠 E-cadherin蛋白表达量显著减少（p<0.05），部分成纤维细胞和肾小管上皮细胞胞表达弱阳性或基本消失，与正常组比较，干预组大鼠肾脏组织 E-cadherin表达量阳性强于模型组，较模型组减弱，差异有显著性意义（p<0.05）。　　结论：　　1．氧嗪酸和尿酸联合应用可以成功诱导大鼠 HUA肾间质纤维化动物模型，成功率高、死亡率低。　　2．HUA能导致尿量增加、肾脏损害，别嘌呤醇通过降低尿酸水平，减少尿量、尿蛋白排出，延缓肾功能损害。　　3．HUA诱导大鼠肾小管间质上皮细胞转分化，可导致细胞紧密连接蛋白 ZO-1 mRNA、Occludin mRNA表达及功能降低，且伴随上皮细胞EMT标志物α-SMA、TGF-β1的表达上调、E-cadherin的表达下调。提示上皮细胞连接破坏可能是HUA启动肾小管上皮细胞损伤及转分化的重要环节。