【摘 要】
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猪β防御素2(PBD-2)作为抗菌肽的一种,具有广谱抗菌作用;而猪γ干扰素(PoIFNγ)具有重要的免疫调节和抗病毒作用。本研究拟通过基因工程技术开发PBD-2与PoIFNγ,以期获得天然
【出 处】
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中国科学院研究生院 中国科学院大学
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猪β防御素2(PBD-2)作为抗菌肽的一种,具有广谱抗菌作用;而猪γ干扰素(PoIFNγ)具有重要的免疫调节和抗病毒作用。本研究拟通过基因工程技术开发PBD-2与PoIFNγ,以期获得天然免疫抑菌活性蛋白,使其在提高仔猪免疫力和抗病能力方面发挥作用。
首先设计融合蛋白序列,将PBD-2置于N端,PoIFNγ置于C端,根据PBD-2和PoIFNγ氨基酸序列,利用DNAworks在线软件,依据毕赤酵母密码子偏爱性,自动合成14条引物,经基因重叠延伸PCR合成嵌合编码序列PBD-2-PoIFNγ,并在此序列的基础上扩增PoIFNγ基因,分别克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαxA,构建重组表达质粒pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ与pPICZαA-PoIFNγ。
重组表达质粒分别经SacⅠ线性化后,电击转化巴斯德毕赤酵母X33,筛选阳性重组子,在含0.5％甲醇的BMMY培养基中诱导72h。SDS-PAGE及Westernblotting结果表明,所获得的重组子能够分别分泌表达PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与PoIFNγ。琼脂扩散法和细胞病变抑制法未检测到融合蛋白的抑菌和抗病毒活性,而PoIFNγ具有明显的抗病毒活性。圆二色谱分析显示PoIFNγ与PBD-2-PoIFNγ的Helix和RandomCoil含量差别较大,推测是融合蛋白未加连接肽而不能正确折叠影响了PBD-2-PoIFNγ的活性。本研究通过毕赤酵母系统成功表达PoIFNγ,也为其工业化生产奠定了基础。
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