一、Bmp2缺失致小鼠牙本质发育缺陷的分子机制研究目的:牙发育是口腔医学研究领域的重点之一,而成牙本质细胞分化是牙发育的重要组成部分,研究成牙本质细胞的分化能够帮助我们更好的理解牙的发育过程。BMP信号家族是牙发育过程中的重要信号通路,在牙发育的各个过程中发挥调控作用,多项研究表明BMP2在牙发育和成牙本质细胞分化过程中具有重要的功能,但是具体的调控机制还并不清楚,本项研究基于Bmp2条件性敲除小鼠,希望能为更加深入的理解BMP2在牙发育和成牙本质细胞分化过程中的作用提供新的数据。研究方法:课题组利用Osx-cre工具鼠和Bmp2flox/flox转基因小鼠构建Bmp2条件性敲除小鼠,在利用micro-CT和组织学检测的方法对Bmp2条件敲除小鼠的牙表型进行确认后,运用高通量测序的手段对Bmp2条件性敲除小鼠的下颌第一磨牙牙乳头组织的转录组表达谱进行检测,之后利用生物信息学的手段对高通量测序的数据进行分析构建调控网络,并且以miRNA为节点筛选出富集的miRNA家族,再对筛选得到的miRNA家族中的各个成员进行功能的验证和靶基因的筛选验证,进而建立成牙本质细胞分化过程中受到Bmp2控制的分子调控途径。研究结果:在利用Osx-cre工具鼠和Bmp2flox/flox转基因小鼠顺利构建出Bmp2条件敲除小鼠之后,我们利用micro-CT对一月龄和三月龄的Bmp2条件敲除小鼠的切牙以及磨牙进行检测,结果显示Bmp2的缺失会导致小鼠出现牙本质的量的减少,牙本质层变薄以及牙髓腔体积变大等牙本质发育缺陷的表型,而对牙胚胎发育时期E13.5、E14.5和E18.5的牙胚的组织学检测并未在Bmp2敲除的小鼠标本上观察到明显的组织结构的变化。我们利用高通量测序的手段针对E18.5天的小鼠牙乳头细胞建立了Bmp2敲除条件下的转录组表达谱,在对数据进行生物信息学分析之后我们发现差异表达基因富集于牙发育、矿化组织分化和间充质细胞分化方面。我们通过调整差异基因的倍数阈值对差异表达基因进行了扩大筛选,结果显示有322个基因在Bmp2敲除的情况下出现了表达的下调,有248个基因在Bmp2敲除的情况下出现了表达的上调,我们将下调的差异表达基因的3’UTR区域的序列提取出来并对其进行miRNA结合位点的富集分析,并和miRNA芯片结果进行联合分析,通过这种策略我们筛选得到mir-181家族作为后续研究对象。mir-181家族总共分为3个cluster包含四种不同的成熟miRNA,分别为mir-181a、mir-181b、mir-181c和mir-181d。我们在Bmp2敲除的小鼠牙乳头细胞中检测了mir-181家族的表达情况,发现在Bmp2敲除的情况下mir-181a和mir-181b的表达上调,mir-181c的表达略微下降而mir-181d的表达水平无法被检测到。之后我们在小鼠牙乳头细胞的成牙本质细胞分化模型中检测了mir-181a、mir-181b和mir-181c的表达情况,其中mir-181a和mir-181b随着分化的进行呈现逐渐下降的表达模式。进一步我们发现,分别过表达mir-181a和mir-181b能够显著抑制小鼠牙乳头细胞的成牙本质细胞向分化,而BMP2蛋白的刺激可以显著抑制mir-181a和mir-181b的表达。利用生物信息学的分析手段我们筛选得到Tgfbr1和Acsl4两个mir-181a/mir-181b的靶基因,通过双荧光素酶实验我们证明Tgfbr1为mir-181a和mir-181b的靶基因而Acsl4为mir-181b的靶基因,并且在成牙本质细胞分化过程中我们检测到Acsl4存在逐步上调的表达模式这和Tgfbr1在成牙本质细胞分化过程中的表达模式是一致的,并且我们进一步证明BMP2的刺激可以上调Tgfbr1和Acsl4的表达。另一方面我们还发现BMP2的刺激可以下调DNA甲基转移酶的表达,而DNA甲基转移酶的抑制会导致成牙本质细胞分化的抑制。结论:Bmp2的缺失会导致mir-181a和mir-181b的上调,而mir-181a和mir-181b的上调会抑制靶基因Tgfbr1和Acsl4的表达,这种调控关系在Bmp2缺失导致的牙本质发育缺陷表型的发生中具有一定的作用,此外Bmp2能够调控DNA甲基转移酶的表达,可能通过DNA甲基化的方式参与成牙本质细胞分化。二、成牙本质细胞分化过程中的DNA甲基化调控研究目的:DNA甲基化是细胞分化过程中基因表达调控的重要表观调控机制,但是在成牙本质细胞分化过程中DNA甲基化所发挥的具体调控机制还并不清楚,有待更多的研究。在本部分实验中我们试图对成牙本质细胞分化过程当中整体的DNA甲基化状态的变化进行描述和分析,并针对一些在成牙本质细胞分化过程中发挥重要的作用的基因所存在的DNA甲基化调控机制进行探讨,从而加深对于成牙本质细胞分化的理解。研究方法:利用生物信息学的手段,对课题组前期针对成牙本质细胞分化过程进行的DNA甲基化芯片进行转录因子结合位点富集分析,以筛选出成牙本质细胞分化过程中受DNA甲基化调控最为显著的转录因子结合位点种类。在此基础之上利用甲基化特异性PCR和测序的方法在人牙髓细胞成牙本质细胞向分化过程中进行验证以确认筛选得到的转录因子位点在不同生物背景下的保守性,之后在体外环境下利用双荧光素酶报告系统对该位点的功能进行验证,在此基础之上利用体外甲基化处理的双荧光素酶报告实验对DNA甲基化调控机制在该位点上的作用进行验证。研究结果:通过对DNA甲基化芯片结果的分析,我们发现在小鼠牙乳头细胞的成牙本质细胞分化模型中,在基因组层面上有7507个区域为D0天特异性的甲基化区域,有6725个区域为D9天特异性的甲基化区域,我们进一步对这些时期特异性的甲基化区域所包含的转录因子结和位点进行富集分析,结果显示在D0天特异性的甲基化区域中最为富集的转录因子结合位点序列为CCCCGCCC,而与这段序列最为匹配的转录因子是SP1。由于在之前的研究中我们发现,在小鼠牙乳头细胞的成牙本质细胞向分化过程中SP1可以调控Klf4的表达,并且DNA甲基转移酶的抑制能够促进Klf4的表达而DNA甲基化芯片的结果也显示Klf4的启动子区域在小鼠牙乳头的成牙本质细胞向分化过程中出现了甲基化水平的降低,这提示SP1可能通过一种受DNA甲基化状态调控的方式调控Klf4的表达。我们在人基因组中的KLF4的启动子区域也发现存在3个CpG岛,为了探索KLF4启动子的甲基化状态在成牙本质细胞分化前后的变化以及在这个过程中SP1对KLF4的转录激活作用是在不同物种之间具备保守性,我们在人牙髓细胞的成牙本质细胞向分化模型中检测了KLF4的启动子的甲基化状态的改变,结果显示KLF4启动子区域的3个CpG岛中只有1号CpG岛在成牙本质细胞分化前后出现了明显的甲基化水平的下降,而在对这段区域进行分析之后我们发现KLF4的1号CpG岛中共有3个SP1的结合位点,在利用Bis-seq的方法对这段区域进行检测之后我们确认了这3个SP1结合位点的甲基化水平随着成牙本质细胞分化的进行而下降,之后我们利用双荧光素酶报告系统对这3个SP1结合位点进行验证,结果显示KLF4启动子上-75位置的SP1结合位点对于SP1的结合和发挥转录激活功能最为重要,我们同时还利用ChIP-qPCR的方法对-75位置的SP1结合位点进行了验证。最后我们利用体外甲基化处理的双荧光素酶报告实验证实了KLF4启动子的甲基化会抑制SP1对其的结合和转录激活功能的发挥。结论:这部分结果证实KLF4启动子区域的1号CpG岛在成牙本质细胞分化后出现甲基化程度的降低,在此CpG岛中的SP1结合位点受到DNA甲基化的调控并显著影响SP1对于KLF4启动子区域的结合和转录激活KLF4功能的发挥。