研究背景：随着近年来种植学在口腔领域的发展和提高,种植体表面处理技术一直是研究的热点和重点；如何形成更好更快的骨结合,成为众多学者的研究目标。生物材料与机体组织间的相互作用主要发生在接触界面,一系列研究表明种植体表面成分、结构、形态、表面能、亲疏水性以及表面电荷等表面特性均对材料-组织间相互作用产生影响,同时细胞粘附是促进组织重建的基础,细胞必须首先在材料上发生适当的粘附,才可能进一步增殖、分化,细胞与材料间良好的粘附作用对于组织再生和植入物的修复起重要作用。因此我们需要深入研究材料的表面特性对细胞在材料表面的粘附、增殖、生长及分化的影响,从微观角度设计和改造材料表面特性,控制和改善材料与细胞、组织的界面反应。大颗粒喷砂-酸蚀(Sandblasted/Large-grit/Acid etched,SLA)技术作为目前商业用种植体最广泛采用的处理方法,由于其处理表面属于不规则表面,并且粗糙度值范围波动较大,对于表面形貌的评价以及其与细胞行为学之间的联系尚不能够得以准确的评估和分析。本实验通过选取Φ100～200μm、Φ200～300μm和Φ300～400μm三个范围的氧化铝颗粒喷砂-酸蚀,获得不同粗化的氧化铝喷砂-酸蚀(Sandblasted/Alumina/Acid etched,SAA)纯钛表面,验证其表面特性与细胞学性能的相关关系,从而获得SAA技术最佳的优化参数。目的：本课题研究不同粗化氧化铝喷砂-酸蚀(Sandblasted/Alumina/Acid etched,SAA)纯钛表面特性以及其对人成骨肉瘤细胞系MG-63生物学效应的影响,为SAA表面处理的性能优化提供理论依据。材料和方法：1.12mm×12mm×2mm规格的医用纯钛片采用A1203颗粒喷砂-酸蚀,由Φ100～200μm、Φ200～300μm及Φ300～400μm大小的A1203颗粒分别得到不同粗化SAA纯钛表面A组、B组和C组。材料表面喷砂后采用10%的HCl/H2SO4混合酸恒温酸蚀40min,最后置于生理盐水中储存(由华南理工大学材料科学与工程学院合作完成)。取未处理的医用纯钛片进行砂磨抛光作为对照组。扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观测钛片表面微形貌,表面轮廓仪测量其表面粗糙度并观测其表面形貌,OCA视频光学接触角测量仪测量其静态水接触角,X-射线光电子能谱仪(X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)对其表面元素进行分析。2.人成骨肉瘤细胞系MG63接种于四组钛片表面,接种后2h、4h、8h及1d的钛片扫描前处理之后进行扫描电镜(SEM)观测细胞粘附、伸展及分化的形态变化；并且对该四个时间段的钛片进行肌动蛋白纤维(F-actin)荧光染色后采用激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy, LSCM)观察其F-actin的变化。对于2h、4h及8h三个时间段通过核的荧光染色计算细胞粘附率比较各组的粘附水平。3.MG63接种于钛片表面,接种后4d、7d及14d的细胞采用MTS法测量OD值比较四组的细胞增殖水平；收集接种后7d、15d及21d的细胞采用ALP-ELISA试剂盒对材料表面成骨细胞ALP活性进行检测,比较四组的细胞生物合成ALP水平。最后利用细胞上清液采用ELISA试剂盒对OPG及TGF-β1进行检测分析。4.以上每个时间段每个处理组均有6个样本量,每个样本重复测量3次。测定数据结果均以x±s来表示。统计学方法采用SPSS13.0统计分析软件,多个样本均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA), Levene’s test检验方差是否齐性,方差齐则采用LSD样本均数间的两两比较,方差不齐则采用近似F检验的Welch方法进行方差分析后,Dunnett’s T3多重比较。假设检验为双侧检验,检验标准0.05,P<0.05时差异有统计学意义。实验结果：1.四组钛片经扫描电镜观测呈现各自的表面微形貌特征,对照组表面为方向一致的沟状划痕；A组、B组和C组均为大孔及微孔共同构成的典型SAA三维形貌。表面算术平均粗糙度值Ra值随着喷砂颗粒粒径的增大而增高,检测结果为C组>B组>A组>对照组。四组钛片静态水接触角测得：对照组润湿性较SAA三组差,SAA三组润湿性均良好。XPS检测表面化学成分,SAA三组均未测得Al元素,B组羟基氧含量最高,A组次之。2.比较四组钛片2h、4h及8h的细胞粘附水平：随着时间的增加,各组表面的细胞粘附率均上升。2h时对照组高于SAA组,4h及8h时SAA组高于对照组。接种后的钛片经扫描电镜观测呈现粘附过程中各组的细胞形态特征,对照组细胞2h时已经开始铺展,4h时沿沟纹方向伸展更为显著,8h时明显建立起细胞间相互接触；SAA组2h时发生粘附、球形附着于大孔洞区域,4h时形态开始伸展,向表面隆起边缘伸出指状突起,1d时细胞伸展更立体广泛并且突触间相互联系,较对照组更加立体、富含胞浆。B组细胞相比于A组及C组粘附伸展较快并且铺展范围较为广泛。C组较A组伸展较慢,伸展范围不及A组广泛。激光共聚焦显微镜观测四组粘附过程细胞骨架的形态特征：2h时,SAA组F-actin均聚集于细胞核周围、细胞膜的内缘,呈环形；对照组F-actin车轮状排列。8h时,各组F-actin不清晰,B组部分F-actin可见束状结构。随着时间发展,SAA组F-actin丝状结构越来越清晰,多方向的网状结构越来越伸展。B组F-actin结构较A组及C组多向分化性更明显。3.MTS法比较四组的细胞增殖水平得出,随着时间增加,增殖活性增加。4d时,对照组高于SAA组。7d时,四组差异不具有统计学意义；14d时对照组低于A组和B组,C组和A组、B组、对照组差异均无统计学意义。采用ALP-ELISA试剂盒对材料表面成骨细胞ALP活性进行检测,比较四组的细胞分化水平得出,SAA组始终高于对照组。其中15d时,SAA三组达到ALP最高值,B组高于A组和C组。OPG结果显示B组高于A组高于C组,C组和对照组差异无统计学意义。TGF-β1结果显示B组高于A组、C组,A组、C组高于对照组,A组C组差异无统计学意义。结论：1.不同的喷砂颗粒大小形成不同粗化的SAA表面微形貌和不同的表面物理化学特性；喷砂颗粒越大,粗糙度越大;过粗颗粒得到的表面形貌不规则度大、分维数大；一定的粗化程度具有较高的羟基氧含量；经生理盐水储存的SAA组的润湿性均优于对照组,该法减少了粗糙度对润湿性的影响。2.在细胞粘附过程中,粘附率随着时间增加而增大。不同的时间段SEM显示了随着时间发展,各组细胞粘附、伸展及分化有序变化的形态特征。CLSM显示了细胞骨架F-actin随时间变化的分布情况。表面润湿性好、材料表面结构利于细胞及生物大分子接触及高的表面活性有利于粘附率的提高及细胞形态的舒展。3.MTS检测显示了各组细胞增殖活性随着时间增加而增高,14d时A组和B组高于对照组。ALP检测显示了SAA表面ALP活性于15d达到最高值。对照组的早期细胞增殖活性高于SAA表面,ALP活性始终为SAA较光滑钛片高。OPG及TGF-β1与ALP活性呈相同的趋势,高浓度的TGF-β1可能促进ALP合成并调节OPG的分泌促进成骨。增殖及分化并不与粗糙程度正相关,均受表面特性影响。