【摘 要】
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本课题选取在癌变肝细胞中丰度高而结构不同的六种天然miRNA: miR-18a，miR-21，miR-192，miR-221，miR-222，miR-224，一种在正常肝细胞中表达最高而在肝癌细胞中不表达的miR-122，以及已
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本课题选取在癌变肝细胞中丰度高而结构不同的六种天然miRNA: miR-18a，miR-21，miR-192，miR-221，miR-222，miR-224，一种在正常肝细胞中表达最高而在肝癌细胞中不表达的miR-122，以及已经被广泛研究的人miR-30，克隆基于该八种天然miRNA结构的靶向萤火虫荧光素酶基因的人工miRNA的表达载体pIRES2-EGFP/miR: pIRES2-EGFP/miR-18a-luc1309, pIRES2-EGFP/miR-21-luc1309, pIRES2-EGFP/miR-122-luc1309, pIRES2-EGFP/miR-192-luc1309, pIRES2-EGFP/miR-221-luc1309,pIRES2-EGFP/miR-222-luc1309, pIRES2-EGFP/miR-224-luc1309, pIRES2-EGFP/miR-30-luc1309。瞬时共转染pIRES2-EGFP/miR、萤火虫荧光素酶表达载体pGL3.0-basic/TK-promoter和作为转染效率参照的海肾荧光素酶表达载pGL4.74[hRluc/TK进入人肝癌细胞Hep3B和HepG2、人正常肝胚细胞HL-7702以及人宫颈癌细胞HeLa，利用双荧光素酶活性检测系统筛选研究发现，筛选的七种肝细胞天然miRNA基础结构在肝癌细胞中对靶基因沉默效果最佳的为miR-221。采用普通逆转录PCR检测发现，转染了miR-221-luc1309、pGL3.0-basic/TK-promoter和pGL4.74[hRluc/TK]的Hep3B、HepG2、HL-7702和HeLa细胞中的萤火虫荧光素酶的mRNA和酶活性水平下降程度相一致;应用实时荧光定量PCR检测发现，miR-221-luc1309的前体相对表达水平高于其成熟的miRNA。因此，可以通过对基于miR-221基础结构的人工miRNA结构加以改造以提高其转录后的加工效率，从面提高对靶基因的沉默效率，用于肝癌基因治疗。
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