冬虫夏草人工繁育技术优化及其侵染菌株的重测序研究

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冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)是我国的传统中药材,具有补肾益肺、止血化痰等功效,因而备受我国消费者的推崇。长期以来,由于人们对野生虫草资源的疯狂攫取,加之缺乏对其生境进行保护,导致天然虫草资源日渐匮乏,市场上的虫草需求缺口也越来越大。研究表明,人工培养的冬虫夏草不仅形态上与野生虫草相似,其所含的化学成分和药理作用也非常相近,因而可作为天然虫草的理想替代品,可降低对野生虫草资源的生态压力。本研究对人工培养冬虫夏草的寄主幼虫饲养环节和菌种鉴定环节进行了研究,获得的主要结果如下:(1)对小金蝠蛾幼虫的饲养条件进行了优化,结果显示其最佳饲养密度为50条/箱(36 cm×28.5 cm×12.5 cm),最佳养虫基质含水量为40%,最佳饲料投放量在400-500 g。对幼虫的生长发育过程进行了调查,显示在0-90 d间的生长较慢,在90-150d间的增速最快,在180-210 d间的生长渐趋平稳,到210-240 d间幼虫开始老化。(2)对采自康定的野生冬虫夏草中的菌种进行了分离,获得3个菌株KD2B201、KD2B202和KD2B203,并对其进行培养条件优化研究;侵染幼虫后显示菌株KD2B201的侵染能力最强。对KD2B201进行了形态学鉴定,表明其为中国被毛孢。聚类分析显示KD2B201的ITS序列以100%的自展支持率与NCBI数据库中冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)的ITS聚在一起,表明本研究分离得到的菌株KD2B201确为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)。(3)比较了喷淋、喂食和针刺三种方法对菌株KD2B201侵染寄主幼虫的效果,显示喷淋方法不能侵染小金蝠蛾幼虫,而针刺方法的僵虫产率和出草率(分别为29.2%和14.6%)都高于喂食方法(分别为24.2%和13.8%)。(4)对菌株KD2B201进行了重测序,获得Raw data 11.886 Gb,过滤后得Clean data11.862 Gb,占总数的99.80%,测序质量较高。将测序数据比对到参考基因组,显示比对率为98.67%,平均深度为92.72X。对基因组序列多态性进行了分析,鉴定出607339个SNP、43322个InDel、7326个SV和4084个CNV。对G蛋白编码基因进行了鉴定,共得109个基因,其中编码Gα(4个)和Gγ(1个)的基因没有发生拷贝数变异(CNV);其余104个为编码Gβ的WD-40重复结构域的基因,其中2个未发生CNV变异,3个的CNV变异发生在基因间区,其余99个则在外显子区存在不同程度的CNV变异,且其中10个存在CNV缺失变异。
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