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鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起的鸭传染病,主要引起鸭群食欲减退,产蛋量下降,生长缓慢,感染率高,死亡率可达20%,严重危害我国鸭养殖业。E蛋白是DTMUV的主要保护性蛋白,能诱导机体产生保护性免疫抗体。本研究原核表达DTMUV保护性抗原E蛋白Domain III,建立基于该蛋白的间接ELISA方法,并对重组E蛋白Domain III的免疫原性进行了初步研究。首先,根据DTMUV AH-F10株全基因组序列,设计一对特异性引物,用于扩增E基因Domain III。通过RT-PCR扩增,获得长约342 bp的目的片段。连接构建p ET32a-E Domain III,将鉴定正确的质粒转化到BL21大肠杆菌中,再用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导,在16℃条件下表达4 h后,可得到重组目的蛋白其大小约为28.0 k Da。经可溶性分析,其结果显示重组目的蛋白在上清和包涵体中均有表达。最后将表达的蛋白进行Western blotting分析,其结果显示获得的重组E蛋白Domain III可以与DTMUV阳性血清产生特异性反应。以纯化的重组E蛋白Domain III作为包被抗原,建立了基于E蛋白Domain III的间接ELISA（E Domain III-ELISA）检测方法。本方法中各项优化条件分别为,最佳抗原包被浓度为10μg/m L,37℃封闭60 min,血清稀释度为1:800,反应时间为37℃,30 min,酶标抗体工作浓度为1:2000,反应时间确定为37℃孵育30 min,显色时间为20 min。应用本方法检测免疫过NS1蛋白、M蛋白、C蛋白和NS3蛋白的小鼠阳性血清,OD450nm值均小于临界值0.386,批内和批间变异系数低于6%。以重组E蛋白Domain III作为抗原免疫BALB/c小鼠,检测该蛋白的免疫原性。将小鼠随机分为3组,I组为试验组,以重组E蛋白DomainⅢ免疫,II组为阴性对照组,以等剂量PBS免疫,III组为阳性对照组,以DTMUV AH-F10株全病毒油乳剂免疫,之后加强免疫2次。三免后眼眶采血,分离小鼠脾脏进行淋巴细胞增殖试验。试验结果显示,试验组的淋巴细胞刺激指数（SI）与阴性对照组相比无显著差异。利用建立的E Domain III-ELISA方法检测小鼠血清中的抗体效价,其多抗效价为1:10000。本试验利用原核表达系统成功表达了DTMUV E蛋白Domain III,并建立了基于DTMUV E蛋白Domain III的间接ELISA方法,有良好的特异性,敏感性和重复性。应用E蛋白Domain III免疫小鼠后可有效诱导小鼠产生体液免疫,具有良好的免疫原性。本试验结果为今后关于该蛋白相关的研究,及制备抗DTMUV疫苗提供前期工作基础。