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研究背景:食管癌(esophageal cancer,EC)是上消化道最为常见的恶性肿瘤,其发病率较高,是我国主要致死肿瘤之一。食管癌的预后较差,其发现时多为晚期,患者失去了手术机会,只能选择放疗、化疗等治疗方法。但这些治疗方法多有副作用且疗效欠佳,因此需要寻找治疗食管癌的新方法。紫檀芪(Pterostilbene,PTE)是一种自蓝莓、葡萄及水曲柳等天然物质提取的甲基化白藜芦醇类物质。与白藜芦醇类似,紫檀芪具有抗氧化、抗炎和抗癌作用,且比白藜芦醇的生物活性更好。研究发现,紫檀芪对肺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌和白血病等恶性肿瘤具有明确的抗癌作用,但其对食管癌EC109细胞是否具有抗癌作用尚未见报道。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是细胞内负责Ca2+储存,新合成蛋白的折叠、转移和修饰的重要细胞器。当细胞出现营养缺乏、缺氧、Ca2+失衡及蛋白糖基化受阻等情况时,内质网的结构和功能就会受到干扰,诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),进而引起ER内未折叠或错误折叠蛋白聚积,激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。正常情况下,UPR可以促进未折叠蛋白降解,修复内质网功能,但当内质网功能无法修复时,便诱导细胞凋亡。重要的是,已有研究发现白藜芦醇可通过ERS通路诱导多种癌细胞的凋亡,但ERS在PTE抗癌中的作用尚未见报道。因此,我们提出以下假设:PTE具有抗食管癌作用,其抗癌作用可能是通过激活ERS进而诱导细胞凋亡来实现的。本项目将从细胞及在体水平研究PTE的抗食管癌作用,在此基础上进一步研究揭示ERS及凋亡在其中的作用。本研究结果将为食管癌的药物治疗的方法和机制研究提供新思路,同时为阐明ERS通路作为药物抗癌的治疗靶点提供理论依据。研究目的:1.研究证实PTE对人食管癌细胞是否有抑制作用。2.研究证实PTE是否通过激活ERS进而诱导细胞凋亡发挥其抗食管癌作用。研究方法:第一部分:细胞水平研究PTE对人食管癌EC109细胞的作用。1.不同浓度PTE对EC109细胞活力和形态的影响。实验分为四组:对照组、PTE50μM、100μM、150μM组,四组均接受不同的药物处理时间:12、24、36小时。CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测细胞活力,倒置显微镜观察细胞形态。2.不同浓度PTE对EC109细胞凋亡的影响。实验分为四组:对照组、PTE 50μM、100μM、150μM组,药物处理时间为24小时。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。3.不同浓度PTE对EC109细胞粘附能力的影响。实验分为四组:对照组、PTE5μM、10μM、15μM共四组,药物处理时间为24小时。粘附实验检测各组细胞粘附率。4.不同浓度PTE对EC109细胞迁移能力的影响。实验分为四组:对照组、PTE5μM、10μM、15μM组,药物处理时间为24小时。细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力。5.不同浓度PTE对EC109细胞ERS和凋亡相关蛋白表达的影响。实验分为四组:对照组、PTE 50μM、100μM、150μM组,药物处理时间为24小时。Western-blot实验检测各组细胞ERS相关蛋白(GRP78、ATF6、p-PERK、p-e IF2α、CHOP)和凋亡相关蛋白(Bcl2、PUMA)的表达情况。第二部分:在体水平研究PTE对人食管癌EC109细胞的作用。1.不同剂量PTE对EC109细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响。实验分为三组:对照组、PTE 100mg/kg和PTE 200mg/kg组。裸鼠皮下移植瘤模型建立后,腹腔注射给药(每周注射5天),每3天测量一次肿瘤体积,20天后取出肿瘤,测量体积。2.不同剂量PTE对EC109细胞裸鼠皮下移植瘤ERS和凋亡相关蛋白表达的影响。将上述所取出肿瘤标本行Western-blot实验,检测各组标本ERS相关蛋白(GRP78、CHOP)和凋亡通路相关蛋白(Bcl2、PUMA)的表达情况。第三部分:细胞水平研究ERS在PTE抗食管癌EC109细胞中的作用。1.PTE+CHOP si RNA转染对EC109细胞活力和细胞形态的影响。实验分成四组:①Control si RNA;②CHOP si RNA;③Control si RNA+PTE 100μM;④CHOP si RNA+PTE 100μM组。EC109细胞先进行si RNA转染,成功后再加入浓度为100μM的PTE处理24小时,CCK-8法测各组细胞活力,倒置显微镜下观察细胞形态。2.PTE+CHOP siRNA转染对EC109细胞ERS和凋亡相关蛋白表达的影响。EC109细胞按步骤1所述进行处理,然后Western-blot检测细胞ERS相关蛋白(CHOP)和凋亡通路相关蛋白(Bcl2、PUMA)表达情况。3.PTE+毒胡萝卜素(thapsigargin,THA)对EC109细胞活力和细胞形态的影响。实验分成四组:对照组、THA 1μM、PTE 100μM和THA 1μM+PTE 100μM组。各组药物处理时间为24小时。CCK-8法测各组细胞活力,倒置显微镜下观察细胞形态。4.PTE+THA对EC109细胞ERS和凋亡相关蛋白表达的影响。EC109细胞按步骤3所述进行处理,然后Western-blot检测细胞ERS相关蛋白(CHOP)和凋亡通路相关蛋白(Bcl2、PUMA)表达情况。研究结果:第一部分:细胞水平研究PTE对人食管癌EC109细胞的作用。PTE(0、50、100、150μM)处理细胞12、24、36小时,细胞收缩、贴壁细胞减少,EC109细胞活力明显降低(P<0.01),并呈浓度和时间依赖性。PTE(0、5、10、15μM)处理细胞24小时,EC109细胞粘附和迁移能力下降(P<0.01)。PTE(0、50、100、150μM)处理细胞24小时,EC109细胞凋亡率增加(P<0.01),GRP78、ATF6、p-PERK、p-e IF2α和CHOP等ERS相关蛋白的表达上调(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl2的表达下调(P<0.01),促凋亡蛋白PUMA上调(P<0.01)。第二部分:在体水平研究PTE对人食管癌EC109细胞的作用。EC109细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立后,腹腔注射PTE(0、100、200mg/kg)20天,肿瘤体积明显减小(P<0.01),且药物浓度越高,药物作用越明显。肿瘤组织的ERS相关蛋白(GRP78、CHOP)的表达上调(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl2的表达下调(P<0.01),促凋亡蛋白PUMA上调(P<0.01)。第三部分:细胞水平研究ERS在PTE抗食管癌EC109细胞中的作用。1.细胞先进行siRNA转染,成功后再加入浓度为100μM的PTE处理24小时。CHOP si RNA转染明显降低了EC109细胞CHOP的表达(P<0.01,与Control si RNA组相比)。CHOP si RNA+PTE明显增加了EC109细胞活力(P<0.01,与Control si RNA组+PTE组相比)。与Control si RNA相比,CHOP si RNA组细胞活力无明显变化(P>0.05)。另外,与Control si RNA+PTE组相比,CHOP si RNA+PTE组Bcl2的表达上调(P<0.01),PUMA的表达下调(P<0.01)。2.EC109细胞经THA和PTE共处理24小时,PTE对EC109细胞活力的抑制作用被增强(两药相互作用指数<1),ERS相关蛋白CHOP的表达上调(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl2的表达下调(P<0.01),促凋亡蛋白PUMA上调(P<0.01)。研究结论:体内和体外实验均表明紫檀芪具有明确的抗食管癌作用,可抑制食管癌EC109细胞活力,降低细胞粘附和转移能力,促进细胞凋亡,其抗癌作用是通过激活ERS进而诱导细胞凋亡实现的。