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蜘蛛毒液是含有不同的药理学特性的多肽分子的“富矿区”。多肽毒素具有高亲和力和多样化的药理学功能,因此,它们成为研究电压门控离子通道结构和功能关系的重要配体分子。Jingzhaotoxin-Ⅲ (JZTX-Ⅲ)是从有毒蜘蛛敬钊缨毛蛛毒液中分离出来的一种多肽神经毒素,由36个氨基酸残基组成。该毒素能特异性地抑制Nav1.5和KKv2.1通道激活,而对其它的大部分离子通道亚型无明显抑制作用。为了更好地阐明JZTX-Ⅲ与Kv2.1通道相互作用的分子机制,我们研究了JZTX-Ⅲ结合该通道的生物活性表面和结合受体位点。实验结果表明JZTX-Ⅲ能够捕获Kv2.1通道的电压敏感元件,抑制Kv2.1通道激活。丙氨酸替代电压敏感桨叶结构(S3b～S4)上的六个氨基酸残基Phe274、Lys280、 Ser281、Leu283、Gln284.和Va1288均大于7倍地降低了JZTX-Ⅲ的亲和力。其中,位于Kv2.1S3-S4胞外连接环上的Ser281是最关键的受体残基,该氨基酸残基被丙氨酸(Ala)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(I1e)、缬氨酸(Val)和谷氨酸(Glu)替代后均能降低毒素的亲和力高于34倍。JZTX-Ⅲ结合Kv2.1通道的生物活性表面由四个疏水性残基(Trp8、Trp28、Trp30和Va133)以及三个电荷残基(Arg13、Lys15和Glu34)组成。虽然三个疏水性残基(Trp8、Trp28和Trp30)构成的疏水性斑片在JZTX-Ⅲ结合钠通道Nav1.5和钾通道Kv2.1的生物活性表面上重叠,但JZTX-Ⅲ抑制Nav1.5和Kv2.1这两种通道亚型的生物活性表面并不完全等同。三个氨基酸残基(Aspl、Glu3、Trp9)是JZTX-Ⅲ抑制Nav1.5通道的关键残基,而位于毒素另一面的三个电荷残基(Arg13、 Lvs15和Glu34)和一个疏水性残基Va133却关键性地影响了JZTX-Ⅲ结合Kv2.1通道。尽管这两个生物活性表面仅仅部分重叠,但是JZTX-Ⅲ能够通过捕获电压敏感元件的保守区域抑制这两种不同类型离子通道的激活。因此,我们的结果揭示了JZTX-Ⅲ采用特殊的分子机制抑制电压门控钠通道和电压门控钾通道。为了更好地理解结构-功能关系,我们分析了JZTX-Ⅲ对表达在ND7/23细胞上的rNav1.8通道电流的影响。我们的研究结果显示JZTX-Ⅲ能够抑制rNav1.8通道的激活。根据hNav1.5和rNav1.8通道DIIS3～S4连接环的序列高度相似性,我们推测JZTX-Ⅲ能够作用于rNav1.8通道的位点4,作用机制类似于JZTX-Ⅲ捕获Nav1.5DIIS3～S4胞外连接环。因此,研究JZTX-Ⅲ与Nav1.8通道相互作用可能为揭示阻断Nav1.8通道的分子机制提供了前景。Jingzhaotoxin-Ⅰ、-Ⅸ和-Ⅺ (JZTX-Ⅰ、-Ⅸ和-XI)是从有毒蜘蛛敬钊缨毛蛛毒液中分离得到的重要的神经毒素。它们含有三对二硫键,采用Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-V、Ⅲ-Ⅵ的配对方式,是典型的ICK结构模体的多肽分子。JZTX-Ⅰ由33个氨基酸残基组成,和目前报道的蜘蛛毒素的序列相似性均不高,仅与JZTX-ⅢI和GxTX1E有50%的序列同源性。JZTX-Ⅸ由35个氨基酸残基组成,但是该毒素与其它的蜘蛛毒素的序列相似性很高。例如,与HaTx1的相似性为63%,与HmTX-Ⅰ的相似性为63%,与SGTx1的相似性为60%,与JZTX-Ⅺ的相似性为71%。JZTX-Ⅰ、-Ⅸ和-Ⅺ是门控调节型毒素,它们能够加快Kv2.1通道的去激活动力学,使通道从激活状态往关闭状态转换,表明这些毒素可能通过电压敏感元件捕获的方式抑制通道的激活。这三种毒素抑制Kv2.1通道呈现明显的浓度依从性,抑制Kv2.1通道的IC50值分别为8.05、1.35和0.57μM。相对于JZTX-Ⅸ和JZTX-Ⅺ而言,JZTX-Ⅰ的氨基酸序列和表面结构明显不同,其结合Kv2.1通道的亲和力也非常低,抑制Kv2.1通道的IC50值分别是JZTX-Ⅸ和JZTX-Ⅺ的6倍和14倍。为了鉴定这些毒素结合Kv2.1通道的受体位点,从而进一步阐明毒素与通道相互作用之间的结构-功能关系,我们将Kv2.1通道S1-S2连接环和S3b-S4电压敏感浆叶结构上的单个氨基酸残基突变成丙氨酸,并采用双电极电压钳技术检测了JZTX-Ⅰ、 JZTX-Ⅸ和JZTX-Ⅺ与Kv2.1通道突变体的相互作用,鉴定了它们结合Kv2.1通道的受体位点。定点突变分析结果显示该通道S3b-S4电压敏感浆叶结构上的四个氨基酸残基(Ile273、Phe274、Glu277和Lys280)是决定JZTX-Ⅰ结合Kv2.1通道的关键受体残基,形成了JZTX-Ⅰ结合Kv2.1通道的受体位点。它们的丙氨酸突变体I273A、F274A、E277A和K280A分别降低了JZTX-Ⅰ的亲和力6倍、10倍、8倍和7倍。另外,位于S3b片段上的三个氨基酸残基(Ile273、Phe274和Glu277)也是决定JZTX-Ⅸ和JZTX-Ⅺ结合Kv2.1通道的关键残基,形成了这两个毒素的结合受体位点。这三个氨基酸残基被突变成丙氨酸后也大大地降低了JZTX-Ⅸ和JZTX-Ⅺ结合Kv2.1通道的亲和力。突变体I273A、F274A和E277A分别降低了JZTX-Ⅸ的敏感性9倍、19倍和16倍,降低了JZTX-Ⅺ的敏感性7倍、11倍和13倍。考虑到这些毒素都能够加快通道的去激活动力学,这些结果表明这三种蜘蛛毒素结合Kv2.1通道的受体位点部分重叠,均采用捕获静息状态电压敏感元件的方式抑制Kv2.1通道的激活。JZTX-Ⅰ由33个氨基酸残基组成,其中6个半胱氨酸残基配对形成3对二硫键。前期工作推测JZTX-Ⅰ是一种类α-毒素,能够抑制大鼠心肌细胞上的TTX-R型钠通道、大鼠DRG神经元上TTX-S钠通道和棉铃虫幼虫神经元细胞钠通道的快速失活。采用全细胞膜片钳技术,我们进一步检测了JZTX-Ⅰ对钠通道亚型的影响,结果发现JZTX-Ⅰ能够高亲和力地结合钠通道亚型Nav1.5(IC50值为0.33μM). JZTX-Ⅰ抑制钠通道Nay1.5的快速失活具有时间依赖性和浓度依赖性,而且不影响该通道的激活和稳态失活动力学。丙氨酸扫描突变Nav1.5通道第四个同源区域DIV上的S3-S4胞外连接环发现突变体D1609是决定JZTX-Ⅰ捕获钠通道DIV的关键残基。这些结果表明JZTX-Ⅰ是位点3毒素,通过捕获钠通道DⅣ S3-S4胞外连接环延缓钠通道快速失活。