人参属(Panax)目前约有18种植物,其中只有人参(P.ginseng)、西洋参(P.quinquefolius)和三七(P.notoginseng)这三种药用植物由于其在临床治疗、保健产品、食品和食品添加剂方面的广泛应用而备受关注;而其他的人参属植物则因分布范围小、产量低或者应用范围小经常被忽视。在东南亚地区,主要分布着三种人参属植物,分别为三七、越南三七(P.vietnamensis)和屏边三七(P.stipuleanatus)。这三种人参属植物在外形特征和地理分布上具有相似性经常被当地少数民族混淆和误食。本研究利用化学指纹图谱结合化学计量法、气质联用技术、SCoT分子标记技术和基于ITS的DNA条形码方法来比较这三种人参属植物的化学指纹图谱、挥发油成分及遗传多样性,从而探讨这三种植物在皂苷成分、挥发油成分以及DNA水平上的亲缘关系。其中,三七作为我国传统药用植物,由于其具有较高的皂苷含量和丰富的化学成分而被称为―人参之王‖。三七中的主要生理活性成分为皂苷类化合物,同时含有氨基酸、多糖、黄酮类、炔醇类以及挥发油等成分。本研究以三七为重点研究材料,对三七种子的成分、皂苷成分的积累特性以及皂苷合成关键酶基因进行探讨,这将有助于人们进一步认识和了解三七中皂苷的积累特性及其次生代谢途径。主要的研究内容如下:1.建立了一套识别和区别三种人参属植物高效、可靠的方法。本研究通过比较不同设备及色谱条件,最终确定了光电二极管阵列检测器(PAD)和SunFire色谱柱是建立指纹图谱更好的选择;基于摸索好的HPLC-PAD方法建立了三种人参属植物的化学指纹图谱,利用22个特征峰可以很容易将它们区分并辨认;为了评估色谱峰之间的细小差异,通过常用的化学计量法——相似性分析、聚类分析和主成分分析研究不同样本之间的关系发现:越南三七和屏边三七在皂苷成分上与三七相比具有更高的相似性,而三七在皂苷成分上展现了更高的多样性,不同的生长年限和肥料处理对三七中皂苷种类的影响极小。2.通过GC-MS技术分析并比较了三种东南亚人参属植物的挥发油成分,研究结果显示,产油率最高的是越南三七,最低的是三七;从三个物种的挥发油中共鉴定出了120种化合物,其中三个物种共有的化合物成分为26种,两个物种共有的化合物为31种;三个物种的挥发油含有数量相似的化学成分(约70种),但是每种化合物在含量上差异较大;三七、越南三七和屏边三七挥发油的主要成分都是具有很好生物学活性的镰叶芹醇,三七的挥发油中含有高含量的穿心莲内酯。基于三种植物挥发油的聚类分析结果显示,越南三七和屏边三七在挥发油成分上具有更高的相似性。3.利用分子标记和DNA条形码技术揭示了三个人参属植物的遗传多样性及其遗传距离。通过scot分子标记技术,对来自东南亚地区的24个植物材料进行研究,最终筛选出了16条scot引物,共产生了153条多态性条带,多态性位点的比例平均为89.47%,这个结果远远高于之前研究的58%;三七由于特殊的生长条件限制,其遗传多样性处于一个相对较低的水平,研究结果与这一情形相一致,即三七的nei氏遗传多样性(h)小于0.1;分子变异分析(amova)的结果显示三七的居群内遗传多样性比例(61.34%)远高于居群间的遗传多样性比例(38.66%)。基于its序列的dna条形码结果显示,三个地理分布一致的人参属物种间的639个位点中有38个位点不同(占总位点的5.9%),而三七种内只有一个位点不同(占总位点的0.05%)。此外,scot分子标记和基于its的dna条形码证明越南三七和三七比屏边三七具有更近的亲缘关系。4.分析了三七种子的营养成分在工业化应用方面的潜质。通过索氏提取技术得到三七种子中的粗脂肪含量为46.35%,高于五加科植物种子的平均值,属于油性种子材料;利用气相色谱仪进一步研究三七种子的脂肪酸成分,发现三七种子油脂中主要含有七种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸的所占的比例(99.56%)远远大于饱和脂肪酸的比例(0.43%),同时含有人体不能合成的亚油酸和亚麻酸,而油酸的比例更是高达95.71%;采用凯氏定氮仪对三七中的蛋白质组分进行分析,结果表明,三七种子中蛋白质的总含量为23.90%,其中麦谷蛋白的含量最高,占蛋白质总量的28.62%;通过氨基酸自动分析仪检测了三七种子中的氨基酸组分,结果显示三七种子中氨基酸种类齐全,共17种,可以满足人体对氨基酸摄入平衡的要求,且第一限制氨基酸为缬氨酸。总而言之,三七种子具有高油酸含量、高不饱和脂肪酸含量、蛋白丰富、氨基酸平衡和低糖等特性。5.探讨了三七不同部位五种主要皂苷在其一个生长周期的积累特性。提出了一套简单、可靠、快速的hplc检测方法,该方法可以同时测定三七中五种主要皂苷类化合物的含量。其中,三七中皂苷的最优提取方案是0.2g三七的样品用8ml70%的甲醇浸泡过夜,然后超声波提取1h。利用优化后的方法,对三七不同部位五种主要皂苷三年的积累特性进行了研究,并根据皂苷成分所占的比例来评估,建议三七的最佳采收时间为第三年的九月下旬。此外,对于三七的田间种植而言,在第三年三七的花蕾期摘去花蕾可以显著增加三七根部皂苷成分的积累。6.克隆出了三七中皂苷合成途径中4个关键酶基因的全长,并对其序列进行了生物信息学分析。根据三七的转录组数据,从三七中克隆出了皂苷合成关键酶的4个基因,分别为法呢基焦磷酸合成酶基因(fpps)、鲨烯合成酶基因(ss)、鲨烯环氧酶基因(se)和达玛烯二醇合成酶基因(ds),核苷酸序列分别包含了一个1029bp、1248bp、1614bp和2310bp的开放阅读框,分别编码342、415、537和769个氨基酸。通过smart预测发现,ss中有两个跨膜结构域,se中有一个低复杂度的区域和4个跨膜结构域,ds中有一个跨膜结构域。7.揭示了三七中皂苷合成4个关键酶的亚细胞定位情况。通过构建三七中皂苷合成关键酶基因的绿色荧光蛋白融合表达载体,并利用基因枪技术转化至洋葱表皮,让重组质粒在洋葱表皮中表达,经过暗培养后在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白的亚细胞定位情况。研究结果显示,转化了pA-7空载体的洋葱表皮细胞中,整个细胞都有绿色荧光散布;转化了A7-FPPS和A7-SS的洋葱表皮细胞中,在细胞质和细胞膜上均可以观察到绿色荧光的分布;转化了A7-SE和A7-DS的洋葱表皮细胞中,只有在细胞膜上观察到了绿色荧光。以上结果说明,FPPS和SS不仅定位于细胞膜,还可能定位于细胞质中,而SE和DS主要定位于细胞膜及其周围。8.研究了三七中皂苷合成4个关键酶基因的原核表达。通过构建三七中皂苷合成关键酶基因的原核表达载体,将重组质粒转化到原核表达菌株E.coli Rosetta中,用IPTG诱导不同时间后,利用SDS-PAGE观察诱导蛋白的表达情况。研究结果显示,在pMAL表达体系中关键酶FPPS、SS和DS都得到了大量表达;其中,在相同浓度的IPTG诱导条件下,FPPS的表达量在诱导15 h时达到最大,而SS和DS均在诱导8 h时的表达量最高。利用低温超高压连续流细胞破碎机对诱导后的菌体进行破碎,分别将上清和沉淀进行分析,从而判定诱导出的蛋白是可溶性蛋白还是包涵体。结果表明,通过pMAL-c2X载体构建的关键酶基因原核表达体系诱导产生的蛋白中,FPPS和SS为可溶性蛋白,DS为包涵体。