目的 一、探讨从SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质分离并鉴定神经干细胞的可行性，为进一步施行神经干细胞移植修复颅脑功能损害实验研究奠定基础，并为非神经组织源性神经干细胞的分离鉴定提供相关参考指标。 二、评价以微小免疫磁珠(平均直径≤50nm，评价直径≤450nm两种)分离提纯SD大鼠这种方法的可行性及其在神经干细胞研究中的应用价值。实验采用流式细胞仪检测细胞纯度，台盼蓝及吖啶橙荧光染色观察活力，扫描电镜下行形态学观察。 三、为了进一步证实分选所获的细胞足神经干细胞，并且探讨免疫磁珠分选后的细胞是否可以进一步用于实验和临床研究，本实验将这些细胞进行体外培养及分化细胞的鉴定，免疫荧光鉴定其活力程度，并以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测相关神经基因表达。 方法和结果 一、以从SD胎鼠室管膜、皮质，SD成年大鼠脑室下区、皮质分离的细胞作为种子细胞来源，在本实验室特制“神经干细胞培养基”中进行神经干细胞培养诱导，单细胞连续传代培养，并以流式细胞术(FCM)、Nestin、NSE及GFAP免疫抗体分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。 四种来源的组织细胞在相应培养条件下均有神经干细胞快速增殖，并有由多细胞组成的神经球形成，经鉴定，该类细胞球表达特殊的胚胎神经干细胞Nestin表面标志;进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度进行培养，单个的细胞又很快变成神经球。对神经干细胞进行连续培养或加血清传代培养可使其进一步分裂增殖，有小芽形成并发育成突起、建立神经纤维联系，其中有的胞体增大，逐渐发育为较成熟的长突起细胞，长突起相互连接、交织成网，经鉴定为分别表达NSE和GFAP的神经元样细胞及神经胶质细胞样细胞。四种组织来源的细胞培养所含有的干细胞数量不同，胎鼠较成年鼠更富含神经十细胞，室扮膜或脑室下区所含神经干细胞较皮质更丰富，皮质来源的神经+细胞和室管膜或脑室下区来源的神经干细胞在形态学和分化程度上无特殊区别。 二、取SD大鼠的胚胎大脑皮层组织制单细胞悬液，用微小磁珠分选出神经巢蛋白困estin)阳性的细胞群，光镜下检测其纯度及活力后进行体外培养，特定条件下诱导分化并以免疫细胞方法检测分化的细胞类型。扫描电镜观察可见细胞表面有数目不等的磁珠紧密结合。分离的神经干细胞纯度为(89.2士4.8)%，细胞存活率95%以上，诱导分化产物中出现NSE阳性、GFAP阳性、Nestin反应阳性细胞群落。 二、利用免疫荧光法鉴定不同培养阶段的!飞细!必胜质;同}「寸川RT一PCR法对分化后细胞进行分析，检测某些相关神经垅因的mRNA水平表达。诱导分化产物中出现有NsE}‘日性、GFAP!‘日性、Nestin反应阳性细胞群落。RT一PCR法分析刘又NA水平有脑因子(BF一1)、Y一氦堆J一酸(GABA)a一受体Y亚单位、酪氨酸扯化酶(TH)及色氨酸羚化酶(TPH)等基因的表达。结论 一、SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质四种组织来源的细胞均含有神经干细胞;神经千细胞不仅存在一于室管膜及脑 一3-室外层组织， 二、微d也广泛存在于皮质。胎鼠脑组织的NSCs、兔疫磁珠法分离提纯神经干细胞纯度高细胞量比成鼠多。，获得细胞数多，，提纯的细胞可用于后续实验。并对细胞的生物活性无明显影响，提纯的细肥则用一丁加块头 三、该方法提纯的神经干细胞体外培养时均可自我增殖，诱导后分化出多种神经细胞，并有多种相关的神经基因表达。