刺参（Apostichopus japonicus）是我国主要的海水养殖棘皮动物,其重要目标性状之一便是疣足数量多少和形态大小,因此关于疣足发生发育的关键调控基因的鉴定及其信号通路的挖掘,将进一步解析刺参疣足发生发育的调控机制,并为以疣足为目标性状的分子标记的研发提供理论基础,具有重要的理论和实践价值。但目前关于刺参疣足的研究成果以组织形态学、解剖学和生理功能等方面为主,对于其发生发育调控机制方面的研究还相对滞后。本研究以刺参疣足为对象,采用比较转录组学筛选出疣足不同部位的差异表达基因及其富集的信号通路,并对筛选出的关键基因利用实时荧光定量PCR技术进行表达水平的验证。鉴定出在刺参疣足顶端特异性表达的表皮生长因子相关基因,包括EGFL8（Epidermal growth factor-like 8,表皮生长因子样蛋白8）具有EGFL结构域的酪氨酸激酶EGFL6（Epidermal growth factor-like 6,表皮生长因子样蛋白6）和FGFRL1（Fibroblast growth factor receptor like 1,成纤维细胞生长因子受体样蛋白1）。利用生物信息学对其功能结构域和潜在互作蛋白进行预测,并进一步通过酵母双杂交技术验证出与之具有直接相互作用的蛋白,初步梳理出参与调控刺参疣足发生发育的关键信号通路。本研究主要内容如下:1.基于转录组的刺参疣足不同部位差异表达基因分析本研究通过比较转录组测序得到疣足顶部（PA）、基部（PB）和皮肤组织（SK）表达具有显著差异的基因,并利用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）两个数据库将测序得到的转录本序列进行相关基因功能与信号通路分析。测序结果发现PA&SK组差异基因数为266,PB&SK组差异基因数为51,PA&PB组差异基因数为374。GO分析显示PA&SK结果主要为细胞信号和分子功能,PB&SK组的的结果主要为生物学过程和细胞相关组分。同时PA&SK组KEGG分析结果差异基因富集的信号通路主要包括:Wnt（Wingless-type MMTV integration site family members）,TGF-beta（Transforming growth factor-beta）和Hh（Hedgedog）信号通路。2.表皮生长因子相关基因的筛选与鉴定本研究通过qRT-PCR（Quantitative Real-time PCR）技术对表皮生长因子相关基因EGFL8、EGFL6、FGFRL1以及Wnt3（Wnt family member 3,Wnt家族成员3）在PA、PB和SK中的表达水平进行验证,结果表明4个基因的表达水平在刺参疣足顶端组织均显著高于其他部分。通过生物信息学预测EGFL8、EGFL6和FGFRL1功能结构域并进行不同物种间的同源序列比对,基于NJ（Neighbor-joining method,邻接法）利用Mega软件构建遗传进化树进行同源进化分析,其氨基酸序列所反映的系统进化关系与传统形态学分类吻合,通过基因核心序列结构域分析表明这3个基因在进化过程中保守程度高,因此刺参表皮生长因子相关基因可能具有与模式生物中类似的的生物学功能以及分子调控机制。3.基于酵母双杂技术的表皮生长因子相关蛋白互作研究本研究通过STRING互作蛋白在线网络数据库将EGFL8、EGFL6和FGFRL1同源序列在模式生物人类（Homo sapiens）以及小鼠（Mus musculus）中的互作蛋白进行预测,同时将预测出的蛋白在刺参基因组中进行序列比对查询并结合最新与表皮生长因子调控机制相关的研究进展,筛选出可能存在直接相互作用的蛋白8对,进一步利用酵母双杂技术对其互作关系进行验证。验证结果发现,EGFL6与Tie1（Tyrosine kinase receptors 1,受体类酪氨酸激酶1）和Angpt2（Angiopoietin-2,血清血管生成素蛋白2）存在相互作用,其中Tie1为EGFL6的跨膜受体蛋白;EGFL8与Notch2（Neurogenic locus notch homolog protein 2,神经源位点缺口同源蛋白2）存在相互作用;FGFRL1与在刺参中的HMG1（High Mobility Group 1,高迁移率族蛋白1）存在相互作用,后者与刺参成纤维细胞生长因子FGF10的基因序列具有较高的同源性,推测其为刺参的FGF家族的一员。综上所述,本研究通过转录组测序技术、生物信息学以及酵母双杂技术,鉴定出在刺参疣足顶端组织特异性表达的表皮生长因子相关基因,并验证出与之存在直接相互作用的蛋白,包括EGFL家族的受体蛋白Tie1和互作蛋白Angpt2以及Notch2;FGFRL1的配体HMG1,初步梳理出以EGF和FGF信号为中心的分子调控机制,为研究刺参疣足发生发育过程调控机制的深入研究和以疣足为目标性状的良种培育提供重要的理论基础。