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复合交联酶聚集体（Combined cross-linked enzyme aggregates,combi-CLEAs）是一种多用途的无载体固定化生物催化剂,用于两个或多个串联或者并联酶的共固定化。这些酶能够同体系催化多级级联或非级联的生物转化。与传统的固定化方法相比,这种固定方法有很多优势,例如更高的酶活性和可控性,更低的生产成本和不需要纯化的酶。氧化还原酶催化的氧化还原反应具有条件温和、专一性高、立体选择性高等优点,在实际应用中具有举足轻重的意义。而80%以上的氧化还原酶催化的反应需要辅酶NAD（P）+/NAD（P）H的参与。但辅酶价格昂贵,大量使用必然会增加催化反应的成本,因此需要对辅因子进行有效的再生。其中还原型辅因子NAD（P）H的再生方法已被广泛报道,但氧化型辅因子NAD（P）+的再生是目前工业催化领域的瓶颈。偶联两种相互平行但催化方向相反的酶用于再生辅因子具有再生效率高、体系简单等优点,但同时游离酶在使用过程中存在回收困难、稳定性差等缺点。通过共固定化酶实现生物催化剂的回收和再利用可以弥补游离酶使用过程中的缺陷。本研究拟用combi-CLEAs来实现NAD+的原位再生,拟通过辅因子的再利用来降低成本。论文的第二章对NADH氧化酶（Nox）和甘油脱氢酶（GDH）进行共固定化制备复合交联酶聚集体。其制备过程包括两步,首先是用沉淀剂将游离酶从溶液中沉淀,再通过交联剂戊二醛交联固定化。为了比较共固定化酶对于NAD+原位再生的效率,分别制备了Nox-交联酶聚集体和GDH-交联酶聚集体。论文考察了固定化过程中沉淀剂的种类和浓度、Nox/GDH的比例、戊二醛的浓度、固定化温度等的影响。选择饱和硫酸铵作为沉淀剂、Nox:GDH为1:5、戊二醛:蛋白为1:20、固定化时间2 h,得到酶活性回收最高的combi-CLEAs和CLEAs混合物,分别为2.14和1.08 U/mg。当NAD+浓度为0.05μM时,combi-CLEAs,CLEAs mixture和混合游离酶的TTN分别为2137,1849和1970,表明共固定化的交联酶聚集体再生NAD+的效率高于交联酶聚集体体混合物和游离酶混合物。经过优化后,combi-CLEAs在55 oC条件下,其t1/2比混合游离酶提高了11%,表现出更高的热稳定性。并且经10次重复利用后,combi-CLEAs和混合CLEAs分别保持了65%和56%的初始活性。最后,在催化甘油生成1,3-二羟基丙酮（DHA）实验中,在反应30 h后,combi-CLEAs能催化生成9.1 mM DHA,分别是混合CLEAs和混合游离酶的2.5倍和2倍。论文第三章对Nox和半乳糖醇脱氢酶（GatDH）共固定化制备了复合交联酶聚集体。同时制备了Nox-交联酶聚集体和GatDH-交联酶聚集体。本章也考察了Nox/GatDH的、戊二醛的浓度、固定化时间等因素对固定化影响。在Nox:GatDH为1:5、戊二醛:蛋白为1:20、固定化时间8 h的条件下,combi-CLEAs和混合CLEAs获得最高酶活力分别为0.19 U/mg和0.17 U/mg。当加入0.05μM NAD+,combi-CLEAs的TTN为134,是混合CLEAs和混合游离酶的1.6倍和1.6倍,表明利用combi-CLEAs再生NAD+的效率高于CLEAs混合物和游离酶混合物。10次循环利用后,combi-CLEAs和CLEAs混合物分别保持了40%和32%的初始活性。本论文制备了两种combi-CLEAs,利用戊二醛与蛋白表面氨基酸残基反应实现酶的共价固定。通过这两种combi-CLEAs实现了辅因子的原位再生。研究结果表明,combi-CLEAs拥有更好的稳定性和重复利用性,在生物催化反应中,combi-CLEAs具有更好的催化效率。本论文的研究工作为进一步研究固定化技术在辅因子再生领域的应用提供了新的思路。