论文部分内容阅读
目的：初步探讨PI3K/AKT通路在血清刺激宫颈癌HeLa细胞UBF1磷酸化及核仁转录中的调控作用。方法：通过Realtime PCR技术和Western Blot技术分别检测血清刺激和血清饥饿对细胞的核仁转录状态及UBF S388磷酸化、PI3K/AKT通路活化的影响；再分别用P13K抑制剂及AKT抑制剂处理血清刺激的细胞以阻断相应通路,借助Realtime PCR技术、Western Blot技术和Lucif erase Assay技术观察PI3K/AKT通路对血清刺激后的核仁转录、UBF S388磷酸化、核糖体基因(rDNA)启动子活性的影响；随后通过Western Blot实验和Luciferase Assay实验来比较PI3K α抑制剂、PI3K β抑制剂及LY294002对HeLa细胞内PI3K/AKT通路的阻断作用、UBF S388磷酸化状态及rDNA启动子活性的影响。最后通过Western Blot技术和PI染色流式细胞术检测P13K通路和Akt通路各自对下游mTORCl通路活化、周期蛋白cyclinE和cyclinA的蛋白水平及细胞周期的影响是否存在差异。结果：血清饥饿时,Pre-RNA合成量随着饥饿时间的延长而减少。UBF及P-UBF(S388)在饥饿24h时呈小幅度减少,且后者较前者减少更明显；超过24h二者又逐渐增加。AKT总量不变,P-AKT随时间减少；血清刺激后Pre-RNA合成量随着时间延长而增加。UBF的总量几乎无变化,P-UBF(S388)蛋白量则随着刺激时间延长而逐渐增加。AKT总量不变,P-AKT刺激后快速增加,维持至6h后又减少。P13K抑制剂LY294002处理组和AKT抑制剂处理组中,Pre-RNA合成量随时间延长不断减少,前者减少得更多。两种处理组Pre-RNA的减少在12h时有统计学意义差异；AKT总蛋白水平无明显变化,P-AKT蛋白在两种抑制剂作用时均逐渐减少,直至检测不到,且P-AKT在LY294002处理组比AKT抑制剂处理组减少得更快；UBF和P-UBF在通路阻断后均减少,以LY294002处理组更显著。PI3K α抑制剂处理6h使UBF及P-UBF(S388)在大幅度减少,AKT及P-AKT(S473)亦呈时间梯度减少；而PI3K β抑制剂处理组时UBF及P-UBF(S388)无明显减少,但AKT及P-AKT (S473)呈减少趋势；PI3K α抑制剂、LY294002及AKT抑制剂均使启动子活性减少,以PI3K α抑制剂组减少得最多,LY294002次之。AKT抑制剂组分别于PI3K α抑制剂组、LY294002组进行组间比较,P值均小于0.05。PI3K α抑制剂组与LY294002组比较得P值为0.772。阻断P13K通路后P-mTOR (S2448)显著减少,cyclinE蛋白量亦减少但cyclinA并未减少,HeLa细胞被停滞在S期；但阻断AKT通路后,P-mTOR (S2448)及周期蛋白cyclinE和cyclinA的蛋白总量均无明显变化,细胞被停滞在G2／M期。结论：血清刺激HeLa细胞使其核仁转录增加,伴PI3K/AKT通路激活和UBF活化；血清饥饿则呈时间梯度式抑制核仁转录、P13K通路及UBF活化。PI3K/AKT通路,至少通过促进UBFS388磷酸化及提高rDNA启动子活性调控血清刺激后的核仁转录；在所有的P13K激酶亚型中,IA型P13K在HeLa细胞中起主要作用。PI3K通路和AKT通路对血清刺激的UBF磷酸化及核仁转录的调控存在差异。血清刺激信号依赖于PI3K/mTORCl/cyclinE通路而非PI3K/AKT/mTORCl通路调控UBF磷酸化及核仁转录。