研究意义随着社会的进步和医学水平的不断提高，加之人们美学标准的相应提高，在救治烧（烫）伤患者生命的同时，对烧伤创面的治疗与处理的标准也不断提高。因此，在烧伤早期对烧伤创面及时正确的处理显得尤为重要。创面的修复主要是由创面内或局部的角质形成细胞（Keratinocytes，KCs）、成纤维细胞及相应的细胞或组织因子之间的相互作用来完成的，其最终结局为损伤部位的再上皮化。在这一过程中角质形成细胞（KCs）的作用显得尤为重要，创面内或局部缺乏角质形成细胞（KCs）或者角质形成细胞（KCs）活性不佳往往会造成创面延迟愈合甚至无法愈合。烧伤往往会造成创面中角质形成细胞（KCs）凋亡、坏死，而在烧伤早期创面中残存少量的KCs和其他细胞，而这些细胞的转归在一定程度上决定了烧伤创面的预后。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）为一种来源于组织间质的成体干细胞，MSCs不仅具有干细胞相关的自我更新、多向分化转分化的潜能，而且还具有较强的旁分泌及免疫调节功能，同时其在促进创面修复和改善组织损伤方面作用明显。脂肪间充质干细胞（Adipose-derived stem cells, ADSCs）为一类来源于脂肪间质的MSCs，其具有MSCs的相关特性。因此本研究拟在烧伤早期通过利用ADSCs的相关特性对烧创面进行干预，检测其对热损伤引起的KCs凋亡的影响，并初步探讨ADSCs可能相关的作用机制，进而为日后采用ADSCs进行创面治疗提供一定的理论依据。研究方法1.取健康雌性BALB/c小鼠5只，采用胶原酶消化法分离纯化脂肪间充质干细胞（ADSCs）。取第3代细胞进行形态学观察，采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面相关标记物CD31、CD34、CD45、CD90、CD105；并行成脂、成骨诱导分化鉴定。2.取雌性新生3d BALB/c子鼠3只，采用胰蛋白酶消化法分离培养角质形成细胞（KCs）；常规复苏人角质形成细胞系（HaCaT细胞）；利用51.5℃的恒温水浴中孵育上述细胞35s建立KCs的热损伤模型；吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色后检测KCs热损伤模型的凋亡情况；流式细胞仪检测热损伤后即刻凋亡率。3. HaCaT细胞以0.9%NaCl饥饿孵育24h后随机分为对照组和实验组，分别以无血清DMEM和体积分数100%ADSCs-CM分别培养12h后，采用AO/EB法检测2组细胞的凋亡情况；HaCaT细胞热损伤后按随机数表法分为常规培养组、无血清培养组、50%ADSCs-CM组、100%ADSCs-CM组，分别以含体积分数10%FBS的DMEM培养液、无血清DMEM培养液、含体积分数50%ADSCs-CM的DMEM培养液（无血清DMEM: ADSCs-CM=1:1）、体积分数100%ADSCs-CM常规培养；于处理后3h、6h、12h、24h采用AO/EB染色法检测各组细胞的凋亡情况；处理12h后，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率和细胞周期分布；Real-time PCR和Western-blot检测Bcl-2、Caspase-3的mRNA和蛋白的表达水平。4.健康雌性BALB/c小鼠20只，背部脱毛后随机分为假烫组和烫伤组，烫伤组采用93±2℃蒸汽烫伤5s，假烫组采用37℃水浴处理5s；于处理后0h、3h、6h、12h、24h及48h切取背部皮肤组织，病理切片后，镜下观察组织病理变化；于伤后0h、3h、6h、12h、24h切取背部皮肤组织，病理切片后TUNEL染色法检测创面内KCs凋亡情况。5.健康雌性BALB/c小鼠18只，背部脱毛后随机分为对照组、DMEM组和ADSCs-CM组，采用93±2℃蒸汽烫伤5s，于伤后0h、2h、4h、分别以等量的无菌PBS、无血清DMEM培养液、体积分数100%ADSCs-CM进行表面湿敷和创面周围相同部位进行局部注射；于伤后6h切取背部皮肤，病理切片后TUNEL染色法检测创面内细胞凋亡情况；免疫组织化学法检测组织内Bcl-2、Caspase-3的表达水平；Real-time PCR和Western-blot检测Bcl-2、Caspase-3的mRNA和蛋白的表达水平。研究结果1.采用胶原酶消化法分离培养的细胞形态规则，与成纤维细胞类似，所培养的细胞在第3代时CD3l-、CD34-、CD45-、CD90+、CDl05+表达率均大于90%，符合ADSCs的免疫学表型；经成脂、成骨诱导培养，其可向脂肪细胞和骨细胞分化，证实培养的细胞为ADSCs。2.原代培养的小鼠KCs形态较好，呈铺路石状样，与典型的角质形成细胞一致，传至第3~5代后细胞易老化；HaCaT细胞复苏后形态良好，细胞轮廓清晰呈典型的铺路石状，细胞状态佳且稳定，形态典型。利用51.5℃水浴孵育小鼠KCs和HaCaT细胞35s后，第3代小鼠KCs热损伤后死亡较多，其即刻凋亡率波动较大，不具有稳定性，无统计学意义（P＞0.05）。热损伤后HaCaT细胞部分死亡脱落，残存的细胞胞体皱缩，细胞周围出现高透亮光圈，即刻凋亡率为（9.8±0.45）%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。3. ADSCs-CM可明显的抑制饥饿引起的HaCaT细胞凋亡。HaCaT细胞于热损伤后12h达到凋亡的峰值。利用体积分数100%ADSCs-CM处理热损伤后HaCaT细胞，其可在mRNA和蛋白水平明显的上调Bcl-2的表达，下调Caspase-3的表达，进而降低HaCaT细胞的凋亡率。处理12h后，体积分数100%ADSCs-CM可明显的缓解热损伤引起的HaCaT细胞G2/M期阻滞。4.利用93±2℃蒸汽作用于小鼠背部皮肤5s，可建立稳定的深Ⅱ°烫伤模型。创面局部及残存毛囊内KCs于伤后6h达到凋亡的高峰。5.在烫伤早期利用体积分数100%ADSCs-CM处理烫伤创面，其可在mRNA和蛋白水平明显的上调组织内Bcl-2的表达，下调组织内Caspase-3的表达，进而减少KCs的凋亡数量。研究结论体外细胞实验和小鼠在体实验证明ADSCs可以在一定程度上抑制热损伤引起的KCs的凋亡，而这种生物学效应是ADSCs通过其旁分泌功能来上调Bcl-2和下调Caspase-3的表达来实现的。本研究结果提示在热损伤引起的KCs凋亡中，ADSCs是通过旁分泌和调节Bcl-2和Caspase-3的表达的双重机制来抑制细胞凋亡的，在烧伤创面治疗早期具有一定的应用潜力。