研究背景FLT3/ITD基因突变见于25-30%的急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia,AML）患者,其特点是:高白细胞,早期复发,生存期短,被NCCN指南确定为高危AML。因此如何能有效控制FLT3/ITD⁺AML疾病进展,明确其发病机制,寻找抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡的关键靶点,一直都是临床和科研工作者关注的问题。（MV4-11细胞作为FLT3/ITD⁺AML的细胞株常为实验研究对象。）在药物治疗方面,索拉非尼（sorafenib,SOR）作为蛋白酶体抑制剂,通过与FLT3酪氨酸激酶竞争ATP结合位点而抑制其活性,干扰信号通路,抑制白血病细胞的增殖分化,诱导白血病细胞凋亡,被认为是FLT3/ITD的靶向治疗药物。但在临床治疗中,单用索拉非尼一直未能获得显著疗效。而作为中国的传统中药,针对于高三尖杉酯碱（Homoharringtonine,HHT）的研究近年来出现了两项重要的医学事件,彰显了HHT在白血病治疗中的地位。1.2012年10月26日,美国Teva制药公司由高三尖杉酯碱合成制得的新型药物—Omacetaxine获得了美国FDA的批准,主要是用于治疗2种以上酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药或不可耐受的慢性髓系白血病（CML）患者。中国的传统中药在国外进行生物再合成,受到了美国临床研究人员的认可,并获得了美国FDA的批准应用于临床治疗,目前尚无先例,可见国外学者对于应用高三尖杉酯碱的重视程度。2.《The Lancet》杂志上的临床研究论著（影响因子:44）:汇总中国17家研究中心以高三尖杉酯碱为核心的组成的三种诱导化疗方案（HAA、HAD、HAE）对于初发AML患者的诱导缓解治疗研究（609例AML患者）,证实了HAA方案的诱导缓解率高达73%,阐述了以HHT为核心的化疗方案对于AML的显著疗效,进一步彰显了HHT在急性白血病临床治疗中的重要地位。由上述两项医学事件说明,无论在基础实验中,还是在临床治疗中,HHT已经成为了白血病研究领域中的重要药物,传统中药已经突破了“传统”。作为血液病学的临床工作者,应当重新认识和审视HHT这一传统中药。这对于白血病的研究和治疗,无论是现在,还是未来都有重要的意义。另一方面,我们在前期的临床治疗中,发现HAD或HAA方案对于FLT3/ITD阳性的AML患者首次诱导缓解率可达到70%左右,远高于IA的首次诱导缓解率,HHT为主的方案为何会有如此显著的疗效?其作用靶点、作用途径究竟在哪里?与索拉非尼的靶向作用又有何不同?研读FLT3/ITD阳性的AML的文献论著发现,有两个重要基因始终伴随FLT3/ITD+AML的疾病进展,5篇发表于《BLOOD》（IF:10）和2篇发表于《Leukemia》（IF:12）的论著都证实了Id1与Mcl-1基因在FLT3/ITD⁺AML发生、进展中的显著作用。而大量前期研究证实,这两种基因启动子上都有STAT5特异性结合序列.两基因都可被STAT5反式激活,故STAT5是上述两种基因产生作用的关键闸门。因此,我们思考:在FLT3/ITD AML细胞中,STAT5是否就是疾病发展的重要“闸门”,关闭了STAT5这一闸门后,Id1与Mcl-1基因的作用是否也会被封闭?是否会影响疾病的快速进展?两种药物对上述基因是否存在抑制作用?有学者已经在白血病干细胞中进行了初步研究,发现应用小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）沉默了STAT5基因后,会诱导白血病干细胞凋亡,同时抑制Mcl-1基因的表达,在FLT3/ITD⁺AML,即MV4-11细胞株中是否也会存在此信号通路?值得研究。综上所述,形成了我们针对于FLT3/ITD⁺AML细胞的研究思路:1.分析MV4-11细胞株中的FLT3/ITD、STAT5、Id1、Mcl-1基因的表达水平;2.应用si-RNA沉默了STAT5基因后,观察MV4-11细胞凋亡以及对Id1、Mcl-1基因的影响,对MV4-11细胞中的分子机制进行研究;3.HHT与索拉非尼对MV4-11细胞株作用后,其生长抑制和诱导凋亡的作用差异,以及对FLT3/ITD、STAT5、Id1、Mcl-1基因的作用影响;4.HHT与索拉非尼两药对MV4-11细胞株是否存在协同抑制作用,联合应用能否提高疗效?5.临床应用高三尖杉酯碱为主的化疗方案:HAD方案与标准的IA方案治疗FLT3/ITD⁺AML的对比研究,观察对疾病的诱导缓解率和预后的差异。研究目的:1.检测MV4-11细胞株（FLT3/ITD⁺急性髓系白血病细胞）,K562细胞株（人红白血病细胞株）,正常人骨髓细胞中FLT3/ITD、STAT5、Id1、Mcl-1基因的表达;2.siRNA-STAT5对MV4-11细胞增殖和凋亡的影响,观察Id1、Mcl-1基因的mRNA水平、蛋白水平的变化,分析沉默STAT5后的分子机制。3.高三尖杉酯碱与索拉非尼单独及联合应用对MV4-11细胞株作用后,对细胞增殖、细胞凋亡的影响以及对FLT3/ITD、STAT5、Id1、Mcl-1基因的表达影响,探讨两药对MV4-11细胞株的分子作用机制。4.应用HAD方案与IA方案首次诱导治疗FLT3/ITD⁺急性髓系白血病患者,观察两方案完全诱导缓解率（CR）的差异,对患者长期总生存（OS）、无进展生存期（PFS）的影响差异。研究方法1.运用RT-PCR和Western Blot分析正常人骨髓细胞,K562细胞和MV4-11细胞中FLT3/ITD、STAT5、Id1、Mcl-1基因mRNA与蛋白的表达差异。2.针对STAT5设计4条siRNA序列,在24小时,48小时不同时间点观察各组转染效果,利用Western Blot及RT-PCR筛选出沉默效果相对显著的序列;siRNA-STAT5转染MV4-11细胞后,MTT法检测细胞的增殖能力,AnnexinV/PI方法检测细胞凋亡,应用RT-PCR及Western Blot检测Id1、Mcl-1基因mRNA与蛋白的表达变化。3.分别选择HHT三个浓度组1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml及索拉非尼50nmol/l,100nmol/l作用于MV4-11细胞,MTT法检测细胞的增殖变化,明确两药物的最佳作用浓度;Annexin V/PI检测细胞的凋亡变化;运用RT-PCR分析MV4-11细胞中FLT3/ITD、STAT5、Id1、Mcl-1基因mRNA的表达;运用Western Blot检测MV4-11细胞中FLT3/ITD、STAT5、Id1、Mcl-1蛋白的表达。4.96例FLT3/ITD⁺急性髓系白血病患者（非APL）,选择HAD方案与IA方案进行首次诱导化疗,回顾分析其诱导缓解率、OS、PFS的差异。研究结果1.基因表达:RT-PCR与Western Blot结果分析证实,FLT3/ITD、STAT5、Idl和Mcl-1基因在正常人骨髓细胞,K562细胞和MV4-11细胞中在mRNA和蛋白水平均有表达,正常对照组中表达最低,MV4-11细胞中表达最高（p<0.05）。2.siRNA的筛选:正常培养的MV4-11细胞和siRNA阴性对照组STAT5的mRNA表达量保持较高水平,其他四组siRNA-STAT5转染的MV4-11细胞mRNA表达量均明显降低,与正常培养的MV4-11细胞和siRNA阴性对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。但siRNA-STAT5-2624组对STAT5的mRNA表达产生明显的抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,选择siRNA-STAT5-2624转染MV4-11细胞进行研究。3.沉默STAT5基因后凋亡分析:分别在24h,48h检测MV4-11细胞不同时间段内的细胞凋亡效果,结果比较差异无统计学意义（P>0.05）。4.沉默STAT5基因后基因表达分析:检测Id1、Mcl-1基因的表达量,结果发现:48小时后的Id1 2^{-（35）（35）C}T值为:0.52（0.46-0.59）,与对照组比较,Id1mRNA表达量差异有统计学意义（p<0.05）。而对比Mcl-1基因的mRNA表达量后发现,48小时后的Mcl-1 2^{-（35）（35）C}T值为1.30（1.20-1.41）,与对照组比较,Mcl-1基因mRNA表达量差异无统计学意义（p>0.05）。5.药物的生长抑制作用:单用HHT对MV4-11细胞生长具有明显的抑制作用,呈浓度、时间依赖性,以10ng/ml,72小时作用最为显著,差异具有显著性（p<0.05）。单用索拉非尼对细胞的生长抑制作用逐渐增强,100nmol/l为最佳作用浓度,各组间差异具有显著性（p<0.05）;两药联合以72小时作用最为显著,与单用HHT、单用SOR比较,均有显著性差异（p<0.05）。6.药物的诱导凋亡作用:单用HHT作用后,24h各浓度组均未见显著凋亡变化,与对照组比较无统计学差异（p>0.05）;10ng/ml HHT在72小时细胞凋亡率才达到最高,统计学差异有显著性（p<0.05）;单用索拉非尼可有效诱导细胞凋亡（p<0.05）;两药联合在72小时后对MV4-11细胞后会产生显著的细胞凋亡效果（p<0.05）。7.药物对FLT3/ITD、STAT5、IdlmRNA表达的影响:HHT作用MV4-11细胞72小时,FLT3/ITD、STAT5、Id1mRNA随HHT浓度升高（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml）逐步下降,各组之间比较有显著性差异（p<0.05）。HHT（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml）与SOR（100nmol/l）两种药物联合作用后,FLT3/ITD、STAT5、Id1基因mRNA的抑制作用随HHT剂量的升高而进行性下降,与单用HHT及单用SOR比较,两药联合能显著抑制FLT3/ITD、STAT5、Id1基因mRNA的表达（p<0.05）。8.药物对Mcl-1基因表达的影响:Mcl-1基因mRNA表达变化不同于前三种基因:单用1ng/ml、5ng/ml HHT对细胞作用72小时后,随HHT剂量升高Mcl-1基因mRNA表达水平未见显著下降,两组与对照组之间比较无显著性差异（p>0.05）;10ng/ml HHT对Mcl-1基因mRNA的表达才有显著性抑制,与对照组比较有显著性差异（p<0.05）。单用索拉非尼72h后,Mcl-1基因mRNA的表达水平进行性下降,为（26.13±3.07）,与对照组比较有显著性差异（p<0.05）。1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml HHT与SOR两种药物联合作用72h后,对Mcl-1基因mRNA的抑制作用随剂量的升高而进行性下降,各浓度组之间比较有显著性差异（p<0.05）,与单用HHT及单用SOR比较,两药联合能显著抑制Mcl-1基因mRNA的表达（p<0.05）。9.药物对蛋白表达的影响:Western Blot检测证实,单用HHT或索拉非尼均能抑制FLT3/ITD、STAT5,Id1蛋白水平的表达,HHT与SOR两种药物联合作用72h后,三种蛋白的表达水平显著下降,与单用HHT及单用索拉菲尼比较均有显著差异。单用10ng/ml HHT或索拉非尼后,Mcl-1蛋白的表达水平下降;两药联合能显著抑制Mcl-1蛋白表达水平,与单用HHT及单用索拉菲尼比较均有显著差异。10.HAD与IA方案的临床研究:HAD方案CR率为78.9%,（30/38,78.9%）,IA方案完全缓解率（CR）率为53.4%（31/58,53.4%）,两治疗组的首次CR率比较统计学分析有显著差异（P=0.02）,HAD的诱导缓解效果强于IA方案。HAD和IA组的4年的总生存（OS）比较有显著差异（P=0.008）,分别为（37%±10%）和（27%±7%）;疾病无进展生存率（PFS）比较也有显著差异（P=0.012）,分别为（62%±10%）和（39%±7%）,HAD方案有利于患者的长期生存。研究结论本课题通过基础实验证实,在MV4-11细胞中,FLT3/ITD、STAT5、Id1、Mcl-1基因的表达显著升高,但是在应用siRNA技术沉默STAT5基因后,并不能诱导细胞凋亡和抑制Mcl-1基因的表达,只能显著抑制Id1基因的表达;推测STAT5与Id1密切相关,但Mcl-1基因可能是与MV4-11细胞凋亡密切相关的关键位点,值得深入研究。单用HHT能抑制MV4-11细胞的生长增殖,但不能有效诱导MV4-11细胞发生凋亡;只有10ng/ml HHT作用72小时才能有效诱导细胞凋亡,抑制Mcl-1基因的表达。HHT与索拉非尼联合用药能显著抑制MV4-11细胞的生长增殖、促进凋亡、抑制FLT3/ITD、STAT5、Id1、Mcl-1基因mRNA和蛋白水平的表达,与两种单药比较均有显著差异,证实两药联合存在协同效应,为临床治疗探索了新的思路。通过HHT的作用效果以及siRNA-STAT5的实验证实,Mcl-1基因与MV4-11细胞的凋亡效果可能密切相关,应是未来FLT3/ITD⁺AML临床与基础研究中重点监测的基因。最后一部分的临床研究验证了以HHT为主的化疗方案（HAD方案）对于FLT3/ITD⁺AML的诱导缓解效果强于经典的IA方案,有利于患者的长期生存,印证了HHT的显著疗效,值得扩大临床样本深入研究。