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抗生素滥用导致细菌耐药性增加已是全球公共卫生问题。因此,寻求广谱、高效的新一代抗菌剂已成为全世界亟待解决的问题。近年来,抗菌肽作为一种新型的抗菌剂引起了国内外相关研究者的广泛关注。抗菌肽(Antimicrobial peptides AMPs),又称肽类抗生素(peptide antibiotics),是一类具有广谱抗菌活性的小分子短肽,是宿主对抗外源性病原体的天然免疫防御系统的重要分子屏障。目前,在家禽体内已发现两大类抗菌肽,即defensins和cathelicidins。相关研究表明,cathelicidins类抗菌肽在体外具有较强的广谱抗革兰氏阴性菌(G-)和革兰氏阳性菌(G+)活性,cathelicidins类抗菌肽具有极大的应用潜力,值得进行更深入的研究。本试验选取乌骨鸡cathelicidins类抗菌肽为目的基因,构建真核重组表达质粒,应用巴斯德毕赤酵母真核表达系统表达目的蛋白并与多种抗生素联用检测其与抗生素联合应用,检测其抑菌作用,以寻求从实质上降低抗生素使用的新方法。根据GenBank中收录的乌骨鸡Cathelicidin-1、-2、-3的基因序列(GenBank序列号:FJ938357、FJ938358、FJ938359),设计三对特异性引物,在其基因两端分别加入酶切位点EcoR I和Xba I。无菌采集乌骨鸡腿骨新鲜骨髓提取其RNA,并以此为模板进行RT-PCR扩增,并克隆至pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-Cath L-1、-2、-3,并测序鉴定。用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切重组质粒pMD18-T-CathL-1、-2、-3获得目的基因Cathelicidin-1、-2、-3,将目的基因连接到经EcoR I和Xba I双酶切的真核表达载体pPICZα-A上,构建重组表达载体pPICZα-A-CathL1、L2、L3,并再次测序鉴定序列的准确性。然后,利用内切酶Sac I对重组表达载体pPICZα-A-Cath L1、L2、L3、质粒pPICZα-A分别进行单酶切,获得线性化质粒。将线性化质粒pPICZα-A-CathL1、L2、L3和pPICZα-A分别电击转入毕赤酵母X-33株感受态细胞中。分别对得到的阳性转化子,利用PCR鉴定阳性转化子。阳性转化子再进行Mut+表型和高拷贝筛选,得到能够正常利用甲醇的高拷贝重组酵母菌株。将筛选到的阳性重组酵母菌株进行甲醇诱导表达,每24 h追加1次甲醇(终浓度分别为1.0%、2.0%),并取1 mL菌液,离心收集上清,直至培养96 h。收集表达上清利用DOC-TCA浓缩蛋白方法处理上清,获得表达的蛋白并进行Tricine-SDS-PAGE鉴定。Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示,出现三条特异性条带,大小分别为7.6 KD、8.1 KD、7.6 KD,与预期结果相符。同时送华大基因公司做质谱鉴定,结果显示表达蛋白准确。此外,结果还显示阳性转化子在1.0%、2.0%甲醇浓度下72 h时蛋白表达量最高且2.0%甲醇浓度下蛋白表达量高于1.0%甲醇浓度下的蛋白表达量。利用96孔板微量稀释法来测定表达产物的抑菌效果。试验结果显示,3种Cathelicidin都对大肠杆菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌表现出不同程度的抑菌效果,其MIC值在2-64μg/mL之间,并且抗菌肽Cathelicidin-1对大肠杆菌1505具有明显的抑菌效果,其MIC值为2μg/mL,优于环丙沙星(MIC=4μg/mL)、氨苄西林(MIC=32μg/m L)、氨苄青霉素(MIC=32μg/m L)、头孢他啶(MIC=32μg/m L)、庆大霉素(MIC=16μg/m L)、左氧氟沙星(MIC=8μg/mL)。将三种cathelicidin抗菌肽与阿莫西林、阿米卡星、阿齐霉素等11种抗生素联用,研究其对大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等菌株的联合抑菌效果,以抗生素的抑菌效果为对照。联合抑菌结果显示,针对不同的菌株,抗生素和抗菌肽联合有协同作用效果,也有拮抗作用效果。在联合抑菌效果中其中,对于绿脓杆菌,阿米卡星单独使用时没有抑菌效果,但是和重组抗菌肽cathelicidin-1、-2、-3联用时,表现出极显著的抑菌效果(P<0.01);对于大肠杆菌1507、0914株,头孢西丁单独使用时没有抑菌效果,但是和重组抗菌肽cathelicidins-1、-2、-3联用时,表现出抑菌效果,并且协同效果极为显著(P<0.01)。但是,对于大肠杆菌1504株,氧氟沙星单独使用时具有抑菌效果,但是和重组抗菌肽cathelicidins-1、-2、-3联用时,表现为无抑菌效果,拮抗效果极显著(P<0.01)。结果表明,禽源cathelicidin抗菌肽与不同抗生素之间存在相互作用,某些特定的组合表现出明显的协同抑菌潜力。针对不同的细菌,探索具有明显抑菌效果的Cathelicidin抗菌肽与抗生素组方是一个降低抗生素使用量的可行方法。