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霍山石斛(Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)又称米斛,属兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)多年生草本植物,为我国特有濒危珍稀中药材。霍山石斛自然分布地域狭窄,生长环境特殊,其资源一直处于濒危状态,主要分布于安徽省、湖北省、江西省、河南省等地。当代药理学研究成果表明:霍山石斛具有益胃生津、提高身体免疫力、抵抗癌症等功效。鉴于该物种濒临灭绝,迫切需要开展霍山石斛的基因组学、居群亲缘关系分析的研究,为霍山石斛资源的保护和管理提供依据。此外,不良商家以次充好、以假乱真,造成市场秩序混乱,损害消费者合法权益,急需建立稳定鉴别方法,为规范霍山石斛及其枫斗制品的市场资源提供技术指导。本文主要进行了以下三个方面的研究:1.霍山石斛叶绿体基因组的测序及叶绿体比较基因组学的研究。对霍山石斛叶绿体基因组序列进行了测序,对霍山石斛及其他已知的石斛叶绿体基因进行基因比较分析。叶绿体基因组的基因组成、基因顺序相似,单拷贝区/反向重复区以及ndh基因存在差异;基于叶绿体基因组的系统发生分析表明:霍山石斛与细茎石斛的亲缘关系最近;ndh基因在石斛属不同种中随机丢失;根据石斛属植物IR/SSC结点附近基因的变化将结点类型分为四类。这些数据的分析,完善了石斛属叶绿体基因组信息,加深了对石斛属植物的认识。2.霍山石斛叶绿体基因组突变热点的筛选及野生居群亲缘关系分析。对霍山石斛及其近缘种细茎石斛的叶绿体基因组进行切割比对,筛选突变热点并进行霍山石斛各居群亲缘关系的分析。结果表明:SNP、InDel、SSR两两之间具有显著正相关性,GC与另外三者均为显著负相关,trnV-rps12基因间隔区的序列变异度(SV)最大,居群聚类图中霍山野生居群(标号为HS,H1,H2)聚为一小支,亲缘关系最近,但各小居群不能很好区分;采自英山的霍山石斛(标号为YS)、龙虎山野生居群(标号为LHS1,LHS2)、伏牛山野生居群(标号为FNS)不能很好聚类,亲缘关系不明。3.霍山石斛及其枫斗制品的鉴定研究。本研究旨在建立一种 Real-time Amplification Refractory Mutation System Quantitative PCR(RTARMS-qPCR)技术快速鉴别霍山石斛及其枫斗类制品。在对20种枫斗类石斛叶绿体基因组中的高变异片段进行比对的基础上,筛选霍山石斛特异的核苷酸位点,采用Primer Premier 6.0软件设计ARMS特异性引物,进行RT-qPCR将霍山石斛枫斗产品从混伪品中鉴别出来。结果表明:霍山石斛能在 NL1/NL4,NL1/NL5,NL4/NL6,TP1/TP2,NL1/NL3,NT0/NT12 这六对ARMS引物对中得到特异性扩增,其扩增曲线最早出现,扩增效率最高,而其它混伪品不能扩增或扩增效率低。且其荧光扩增曲线的Ct值较低,其他混伪品的Ct值较高,统计学分析表明差异极显著(P<0.001)。因此该系统可以灵敏、稳定鉴别霍山石斛及其枫斗。