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动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）本质上是脂质代谢障碍驱动的一种慢性炎症性疾病,是导致冠心病、脑卒中和心肌梗死等心血管不良事件的主要病理基础。近年来,由富含胆碱的饮食代谢所产生的三甲胺-N-氧化物（Trimetlylamine oxide,TMAO）已被证实是一种新的促AS进展的独立危险因素,可通过激活磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B（Phosphatidylinositol 3 kinase/Protein kinases,PI3K/Akt）信号通路以及核转录因子-κB（Nuclearfactorkappa-B,NF-κB）信号通路,启动血管炎症反应并导致内皮功能障碍,加速AS进程。课题组前期研究已证实,痰瘀同治方具有抗炎、抗氧化及降脂等作用,对高脂血症、心肌缺血再灌注损伤等多种心血管疾病均具有良好疗效。因此,本研究以高脂高胆碱饮食诱导的ApoE-/-小鼠为AS研究对象,通过在体实验研究痰瘀同治方对模型动物血脂水平、斑块形成、主动脉炎症因子表达以及肠道菌群代谢物TMA/TMAO水平的影响,并在此基础上,以PI3K/Akt/NF-κB信号通路为切入点,在体外实验中探索痰瘀同治方对TMAO刺激的内皮细胞微环境改变和炎症反应变化作用的分子机制,从系统整体水平和细胞分子水平两方面阐述痰瘀同治方延缓AS慢性血管炎症的作用及其机制。第一部分痰瘀同治方对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化血管炎症干预作用研究目的:通过构建高脂高胆碱饮食诱导的ApoE-/-小鼠AS模型,观察TMAO水平与AS慢性炎症发展之间的相关性及痰瘀同治方的干预作用。方法:75只ApoE-/-小鼠高脂高胆碱饮食饲养7周后,随机分为模型组、阿托伐他汀组、痰瘀同治方低、中、高剂量组,各药物干预组给药3周,15只C57BL/6J小鼠普食饲养10周作为空白对照组。采用生化分析观察各组小鼠血脂水平变化,HE染色观察主动脉根部局部组织病理变化,主动脉大体及其根部油红O染色计量斑块病变区域面积百分比,免疫组化检测主动脉根部白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）、单核细胞趋化因子蛋白-1（Monocyte chemokine protein,MCP-1）细胞因子表达水平,液相色谱-质谱联用检测血清TMA及TMAO含量,蛋白免疫印迹法检测主动脉组织PI3K/Akt/NF-κB信号通路磷酸化/总蛋白表达。结果:（1）高脂高胆碱饮食可诱导ApoE-/-小鼠引起循环TMA及TMAO水平异常升高,加速AS进展,主要表现为小鼠血清总胆固醇（Totalcholesterol,TC）、甘油三酯（Triglycerides,TG）、低密度胆固醇脂蛋白（Low density cholesterol lipoprotein,LDL-C）水平显著升高（p＜0.01）、高密度胆固醇脂蛋白（Highdensity cholesterol lipoprotein,HDL-C）水平显著下降（p＜0.01）,主动脉整体和根部斑块大面积形成（p＜0.01）,动脉内膜增厚伴随胆固醇结晶出现,动脉壁炎症因子（IL-1β、MCP-1）表达显著增加（p＜0.01）以及主动脉PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达明显上调（p＜0.01）。Spearman相关性分析结果显示,小鼠血清TMAO/TMA水平与血清TC、TG、LDL-C 水平、主动脉瓣处斑块面积、炎症细胞因子表达（IL-1β、MCP-1）和PI3K/Akt/NF-κB通路磷酸化/总蛋白表达呈显著正相关（p＜0.05）,与主动脉整体斑块面积和TNF-α表达存在正相关关系,但相关性不显著（p＞0.05）,与HDL-C呈负相关（p＞0.05）。（2）痰瘀同治方低、中、高剂量组均能显著降低模型组小鼠血清TG和TC水平,其中痰瘀同治方高剂量组能够显著减少LDL-C含量（p＜0.05）,但各剂量组痰瘀同治方对HDL-C的干预作用不明显;（3）痰瘀同治方中、高剂量组均对模型组小鼠主动脉斑块脂质核的增大有显著改善作用（p＜0.05）,伴随着病变区域炎性浸润程度减轻,其中高剂量组的改善作用尤为突出;（4）痰瘀同治方低、中、高剂量组均可显著下调主动脉根部IL-1β和MCP-1的抗原表达水平（p＜0.01）,TNF-α抗原表达水平在痰瘀同治方干预后有下降趋势（p＞0.05）;（5）痰瘀同治方各剂量均可显著下调高脂高胆碱饮食诱导的ApoE-/-小鼠血清TMA及TMAO水平（p＜0.05）,下降趋势呈剂量依赖性;（6）痰瘀同治方低、中、高剂量组PI3K和NF-κB磷酸化/总蛋白的表达水平显著下降（p＜0.01）,痰瘀同治方高剂量组Akt磷酸化/总蛋白表达水平明显降低（p＜0.05）。结论:长期高脂高胆碱饮食可引起ApoE-/-小鼠体内循环TMA及TMAO水平的异常升高,同时造成血脂代谢紊乱、斑块形成与血管炎症反应加剧以及PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活,痰瘀同治方处理可通过下调血清TMA和TMAO水平,降低血脂和血管炎症因子释放,减小斑块生长面积,抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路的活化来减轻动脉血管的炎症损伤,延缓AS进程。第二部分痰瘀同治方通过PI3K/Akt/NF-KB通路调控TMAO诱导的内皮细胞炎症作用机制研究目的:观察TMAO对内皮细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活作用及痰瘀同治方的作用机制及具体靶点。方法:采用100μM TMAO处理人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelialcells,HUVEC）24h,建立内皮细胞损伤模型。实验分为6组:空白对照组,TMAO 干预组（100μMTMAO）,PI3K 抑制剂组（20μMLY294002）,痰瘀同治方含药血清低（5%）、中（10%）、高（10%）剂量组,各组给予相应药物干预24h。CCK-8法检测细胞存活率,流式CBA多因子检测培养HUVEC上清液中炎症细胞因子含量,蛋白免疫印迹法检测细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路磷酸化/总蛋白表达。结果:（1）不同浓度的TMAO及痰瘀同治方含药血清干预HUVEC细胞24h对细胞存活率未见明显抑制作用（p＞0.05）;（2）与体内实验中TMAO血清检测浓度接近,100μM TMAO干预HUVEC细胞24h能够显著上调NF-κB总蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平（p＜0.01）,并能显著增加IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1及TNF-α的分泌水平（p＜0.01）;（3）痰瘀同治方低、中、高剂量含药血清及PI3K抑制剂均可明显抑制TMAO诱导的细胞因子分泌,使HUVEC培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1及TNF-α水平均显著降低（p＜0.05）;（4）痰瘀同治方含药血清各剂量组与PI3K抑制剂组HUVEC细胞PI3K、Akt与NF-κB磷酸化/总蛋白的表达水平均显著下调（p＜0.05）。结论:TMAO可激活HUVEC细胞内的PI3K/Akt/NF-κB信号通路,促使炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1及TNF-α释放,痰瘀同治方含药血清处理可显著抑制TMAO诱导的HUVEC细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活及炎症细胞因子释放,发挥抗AS血管炎症和保护内皮细胞的作用。