氟喹诺酮类抗生素(FQs)和四环素类抗生素(TCs)是两类具有代表性的β-双酮类抗生素(DKAs)。近几年，DKAs已经广泛用于人类和动物，特别是添加到动物饲料中，防止动物产生疾病和促进其生长，或是在水产养殖中抑制细菌繁殖。虽然大多数DKAs的半衰期都比较短，但是由于在人类活动中被频繁、大剂量的使用，使得DKAs在环境中出现“假持久”的现象。体内和体外一些实验证实，某些抗生素长期作用对生物具有内分泌干扰性和雌激素效应，导致免疫毒性、雌性化、生殖失败、流产等。但是，很少有研究去探究其分子致毒机理。因此我们利用高通量转录组测序技术，从分子层面探讨DKAs的致毒效应及机理，以及借助荧光定量PCR和原位杂交的方法进一步得到验证。　　目的：　　本研究通过不同处理组（对照组、6.25mg/L、12.5mg/L DKAs处理组）斑马鱼RNA文库的构建和mRNA及lncRNA高通量测序技术，鉴定斑马鱼在正常养殖条件下和不同浓度的DKAs暴露下的lncRNA，以及这些lncRNA及其靶基因的表达丰度在DKAs暴露下是否存在显著性差异。并通过荧光定量PCR和原位杂交技术来验证lncRNA的表达及其显著差异性变化，寻找一批斑马鱼与DKAs暴露相关的lncRNA。通过生物信息学预测lncRNA的靶基因，再与mRNA高通量测序结果相结合，筛选出在DKAs处理下差异表达的lncRNA的靶基冈，并通过qRT-PCR去验证。接下来我们根据lncRNA差异表达靶基因的功能，进一步探究DKAs对斑马鱼的毒性。　　方法：　　1.以模式生物斑马鱼（Danio rerio）为实验材料，选取六种广泛使用的β-双酮类抗生素:三种氟喹诺酮类抗生素（环丙沙星、氧氟沙星及恩诺沙星）、三种四环素类抗生素（盐酸强力霉素、盐酸金霉素及土霉素）作为实验药物，建立斑马鱼DKAs复合暴毒品系。　　2.构建对照组、6.25mg/L、12.5mg/L三组斑马鱼相应的RNA文库，本实验测定了对照组、两个DKAs处理组3月龄斑马鱼的整体转录组，通过Illumina系统的高通量测序得到大量lncRNA，经过数据的挖掘和筛选于lncRNA数据中筛选出一批符合标准的lncRNAs。　　3.以差异倍数≥2，p-value≤0.05，表达丰度≥50为条件，筛选不同DKAs暴露下表达丰度均有显著差异的lncRNA，然后通过lncRNA与mRNA的位置关系或lncRNA与mRNA序列之间形成二级结构所需自由能的大小预测差异表达lncRNA的靶基因，并根据差异倍数≥2，p-value≤0.05筛选出差异表达的靶基因。　　4.对筛选出来的差异表达的lncRNA和靶基因设计荧光定量PCR的特异性引物，利用SYBR Green定量PCR验证三组中lncRNA以及靶基因的差异表达。　　5.合成筛选出的差异表达的lncRNA探针，通过原位杂交技术来探究其在组织脾脏和肝脏中的表达特异性以及差异。　　6.通过对差异表达lncRNA靶基因分析探究差异表达lncRNA主要功能，进一步探究DKAs对该功能的毒性。　　结果：　　1.斑马鱼三个样本提取的总RNA质量均满足OD260/OD280＞1.8，表示可以用于后续测序分析。　　2.高通量测序对照组、6.25mg/L和12.5mg/L处理组分别获取71，532，662、65，426，852、84，020，924条raw reads。经过筛选和过滤，共预测出54，153条lncRNA符合lncRNA筛选条件。　　3.根据差异表达lncRNA筛选条件6.25mg/L处理组与对照组相比我们筛选出44个lncRNA基因差异表达，12.5mg/L处理组与对照组相比，有39个差异表达lncRNA基因。其中，有10条lncRNA在6.25mg/L处理组和12.5mg/L处理组与对照组相比表达都有差异。　　4.qRT-PCR检测对照组、6.25mg/L处理组和12.5mg/L处理组三个样品中大部分差异表达的lncRNA和靶基因的转录水平，并与对应的高通量测序结果表达变化趋势进行比较，qRT-PCR结果与转录组测序结果一致，证明转录组测序结果可靠。　　5.合成DIG标记的lncRNA探针，通过原位杂交技术来进一步验证筛选的lncRNA在对照组、6.25mg/L和12.5mg/L处理组中不同组织中的分布及表达情况。结果表明筛选的三条与免疫功能相关的lncRNA中TCONS_00129029和TCONS_00027240在肝脏和脾脏中表达均受到DKAs的抑制，TCONS_00017790在肝脏和脾脏中表达量升高。　　6.我们进一步对三个浓度DKAs处理对斑马鱼的免疫毒性进行研究，我们研究了与免疫相关的生物标志物，免疫器官的病理切片及透射电镜。　　(1)β-双酮类药物对补体C3、IgM、内脏团和脑部的溶菌酶含量以及碱性磷酸酶活性均造成不同程度的影响，其中脑中溶菌酶和血液中补体C3含量均在DKAs处理后下降，碱性磷酸酶、IgM和内脏团中溶菌酶含量在DKAs低浓度处理表达量升高，高浓度处理下降。　　(2)对斑马鱼的免疫器官脾脏、小肠的HE病理切片显示DKAs导致斑马鱼小肠肌肉层溶解、杯状细胞数量增加，脾脏组织中棕色异染颗粒增多、细胞分布不均。　　(3)在透射电镜下我们可以进一步观察到DKAs药物浓度处理造成小肠柱状上皮细胞和上皮细胞线粒体空泡化，肥大细胞水肿，上皮细胞变形和凋亡。　　(4)透射电镜下对照组鳃丝清晰可见血道、扁平上皮细胞与支持细胞，支持细胞细胞核明显可见，充盈整个胞体中，且染色质分布均匀，扁平上皮细胞细胞质与细胞核内染色质分布均匀，且与支持细胞之间窦状隙明显可见，而三个药物处理组中细胞与细胞之间界限不清晰，上皮细胞脱落，血管中红细胞溶解，支持细胞细胞核固缩，其中12.5和50mg/L处理组支持细胞细胞质发生严重肿胀溶解。　　结论：　　利用新一代高通量测序技术对β-双酮类抗生素长期暴露的斑马鱼成鱼进行转录组和lncRNA测序，筛选出一批显著差异表达的基因和lncRNAs。运用生物信息学方法对差异表达lncRNA的作用靶基因进行KOG功能注释及涉及的代谢通路KEGG Pathway富集分析，构建了lncRNA与作用靶基因的调控网络。针对调控免疫功能相关靶基因的差异lncRNA，通过qRT-PCR、原位杂交技术验证了药物暴露下在肝脏和脾脏中的异常变化，同时从免疫相关标志物的变化、免疫器官病理组织损伤以及透射电镜的观察佐证了β-双酮类抗生素低剂量长期暴露对斑马鱼免疫系统的致毒效应。　　总之，我们的研究表明在DKAs长期慢性暴毒情况下会导致斑马鱼体内部分与免疫功能相关的lncRNA及其靶基因的差异表达，生理指标的异常以及免疫器官的组织损伤进一步证明了DKAs对斑马鱼的免疫毒性。