氟中毒是一种严重危害人类健康的全身性疾病。过量氟暴露可引起机体慢性、潜在性危害。尤其是氟暴露对生殖系统的影响，目前已受到国内外相关学者的广泛关注。氟是一种电负性元素，化学性质极其活泼，其可直接攻击氧，干扰氧代谢造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生过多。近年来大量研究发现，氟中毒对细胞或组织的损伤作用可能是通过氧化应激而导致的。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指细胞受到内外因素刺激时，内质网腔中错误折叠和未折叠蛋白质过度蓄积，进而促发未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。有研究发现，ERS可能与氟骨症及氟斑牙的发病过程密切相关。然而，ERS是否参与氟中毒生殖损伤机制，尚不清楚。另外，有学者发现，ROS可作用于内质网，导致ERS持续进行性激活，氧化应激可能介导了ERS信号通路。　　鉴于氧化应激和内质网应激在氟中毒发生过程中不可忽视的作用，且ROS/氧化应激与内质网应激之间存在不可分割的内在联系。本研究拟通过建立氟中毒动物模型与染氟细胞模型相结合的方式，首先观察氟中毒雄性大鼠的生殖损伤相关效应，检测机体内氧化应激水平，分析氧化应激在氟致生殖损伤中的可能作用机制；观察ERS促发未折叠蛋白级联反应中标志性信号分子在损伤中的变化，进一步分析氧化应激介导的ERS效应及其结局，探讨以上生物事件发生的关联。同时结合体外实验，用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）和小分子干扰RNA（smalll interfering RNA,siRNA）技术对上述关联加以验证。　　目的:　　本研究拟通过体内实验和体外实验相结合的方法，探讨氟致生殖损伤中的氧化应激和内质网应激状态，以此综合评价氟对生殖损伤的影响及其与氧化-内质网应激的关联，为阐明氟中毒生殖损伤可能形成机制提供新的思路。　　方法:　　1.实验动物处理及分组　　4周龄健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只。将大鼠称重编号后随机分为4组，每组15只，即对照组；氟化钠（NaF）组；NAC组；NaF和NAC联合作用组。对照组给予0.9％氯化钠溶液；NaF组、NAC组及NaF+NAC组采用的剂量和试剂分别为：25mg/kgBw?d NaF溶液、150mg/kgBw?d NAC溶液和（25 mg/kgBw?d NaF+150mg/kgBw?d NAC）溶液，各处理组采用灌胃的方式染毒，染毒时间为7周。　　2.氟暴露致机体生殖损伤效应相关指标检测　　染毒7周后，称重、麻醉抽取腹主动脉血并处死大鼠，立即解剖取睾丸、附睾，称重并计算脏器系数，进行精子密度、精子活动率和精子畸形率的测定；采用氟离子选择电极法测定睾丸中氟的含量；酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清睾酮含量；睾丸组织HE染色镜检；TUNEL法检测睾丸组织细胞凋亡。　　3.睾丸组织中氧化应激水平检测　　采用生化方法检测各处理组大鼠睾丸组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力。　　4.睾丸组织中内质网应激相关指标检测　　Western blot检测各处理组大鼠睾丸组织中GRP78、PERK、eIF2α、p-eIF2α及CHOP蛋白表达水平。　　5.细胞处理及分组　　16~20日龄健康雄性SD大鼠，对睾丸支持细胞进行分离、培养、纯化以及鉴定。提取的原代细胞用含10%胎牛血清的 DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。根据 NaF和 NAC单独或联合作用的方式，分为以下8组：0μg/ml NaF（对照组）、6μg/ml NaF组、12μg/ml NaF组、24μg/ml NaF组、2 mmol/L NAC组、6μg/ml NaF+2 mmol/L NAC组、12μg/ml NaF+2 mmol/L NAC组和24μg/ml NaF+2 mmol/L NAC组，各组加入相应药物培养24 h。　　6.睾丸支持细胞存活率及凋亡相关指标检测　　MTT法检测各处理组的细胞活性；采用脂溶性荧光探针JC-1检测细胞线粒体膜电位下降水平；采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平。　　7.睾丸支持细胞氧化应激水平和Nrf2核转位情况　　采用荧光探针DCFH-DA检测细胞中活性氧（ROS）含量；生化方法检测细胞内MDA及SOD水平；Western blot测定Nrf2胞浆和胞核蛋白表达，观察细胞内Nrf2核转位情况。　　8.睾丸支持细胞内质网应激相关指标检测　　Western blot法测定各处理组睾丸支持细胞的GRP78、PERK、eIF2α、p-eIF2α和CHOP的蛋白表达。　　9. siRNA技术沉默CHOP　　采用riboFECT? CP转染试剂将设计合成的CHOP-siRNA及阴性对照siRNA转染至睾丸支持细胞，实时定量PCR和Western blot分别检测转染后的CHOP mRNA和蛋白表达情况，以验证转染效率，最后采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测CHOP沉默后的细胞凋亡率变化。　　结果:　　1.分析大鼠体重、睾丸和附睾重量及其脏器系数，结果发现，与对照组相比， NaF组的体重、睾丸和附睾重量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；分析大鼠精子质量，结果发现，与对照组相比，NaF组的精子密度和精子存活率降低，而精子畸形率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与 NaF组相比，NAC联合作用组的精子密度和精子存活率升高，而精子畸形率降低，差异有统计学意义(P<0.05)；检测睾丸氟含量，结果发现，与对照组相比，NaF组及 NAC联合作用组的睾丸氟含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)；检测血清睾酮含量，结果发现，与对照组相比，NaF组及NAC联合作用组的睾酮含量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与 NaF组相比，NAC联合作用组的睾酮含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。　　2.睾丸组织HE染色的镜检结果显示，对照组和NAC组的生精上皮细胞形态结构完整且无脱落细胞，可见大量成熟精子；NaF组的生精细胞间结构疏松，生精细胞数量减少，管腔中有脱落的精子和组织；与NAC联合作用后，生精细胞结构基本完整，管腔脱落细胞减少。　　3. TUNEL法检测睾丸组织细胞凋亡情况，结果发现，与对照组相比，NaF组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与NaF组相比，NAC联合作用组细胞凋亡水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。　　4.检测睾丸组织氧化应激水平，结果发现，与对照组相比，NaF组MDA含量增高，而SOD和GSH-Px活力降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与NaF组相比，NAC联合作用组的MDA含量降低，而GSH-Px活力升高，差异有统计学意义(P<0.01)。　　5.检测睾丸组织中内质网应激相关蛋白表达情况，结果发现，与对照组相比，氟暴露上调了GRP78、PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白表达水平，差异有统计学意义(P<0.01)，而NAC抑制了GRP78和CHOP蛋白表达的上调，差异有统计学意义(P<0.01)。　　6.检测睾丸支持细胞存活率及凋亡情况，结果发现，12μg/ml和24μg/mlNaF处理组的细胞存活率下降，各 NaF处理组的线粒体膜电位水平显著降低且细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。NAC提高了细胞存活率、削弱线粒体膜电位的下降，并减少了细胞凋亡的发生，差异有统计学意义(P<0.01)。　　7.检测睾丸组织中氧化应激水平和Nrf2核转位情况，结果显示，与对照组相比，各 NaF处理显著提高了睾丸支持细胞内的 ROS水平且降低了 SOD活力，12μg/ml和24μg/ml NaF组MDA含量显著上升，差异有统计学意义(P<0.01)。随着NaF剂量的增高，各NaF组的Nrf2胞浆蛋白表达依次明显下调，而Nrf2胞核蛋白表达依次明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)。NAC显著拮抗了细胞氧化应激的效应，并促进Nrf2核转位，差异有统计学意义(P<0.05)。　　8.检测睾丸支持细胞内质网应激相关蛋白表达情况，结果显示，各NaF处理组的GRP78蛋白表达显著上调，12μg/ml和24μg/ml NaF组的PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白表达显著上调，差异有统计学意义(P<0.01)。NAC在不同程度上拮抗了相关蛋白的表达，差异有统计学意义(P<0.01)。　　9.采用siRNA技术有效沉默了CHOP的mRNA和蛋白表达，差异有统计学意义(P<0.01)，沉默CHOP表达后，24μg/ml NaF组的细胞凋亡率显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。　　结论:　　1.内质网应激是氟中毒大鼠生殖损伤的重要机制之一。　　2. NaF可通过激活ERS中PERK/p-eIF2α/CHOP途径介导大鼠生殖损伤。　　3.氧化应激通过启动内质网应激信号通路在氟中毒大鼠生殖损伤中发挥作用。