原发性脊髓损伤（primary spinal cord injury）后的继发性脊髓损伤（secondaryspinal cord injury，SSCI）是造成功能障碍的重要原因。血管病理变化和继发的相关变化对于继发性损伤的进展起重要作用。血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）的破坏会导致的大量血源性物质渗漏到脊髓实质，引发炎症和神经胶质增生。组织挤压、血栓形成和血管痉挛引起的损伤后缺血会导致神经元死亡，且损伤后缺血与损伤严重程度呈线性相关。我们先前的研究表明，不断扩大进展的继发性损伤空洞边缘存在两个缺血区，距空洞较近的缺血区内大多数的神经元变性、死亡，而在较远区域，虽有缺血迹象，但神经元尼氏体形态无太大改变，提示这些神经元可通过改善血液循环而被挽救。因此，增加脊髓的血流量可能是减轻继发性损伤一种有效策略。纤维蛋白原（Fg）是由肝细胞分泌的分子量为340kDa蛋白质，以较高浓度存在于血液中。一旦凝血级联反应被激活，凝血酶即降解Fg的α和β链形成纤维蛋白单体，后者聚合形成纤维蛋白多聚体，通过与血小板相互作用，完成凝血过程。此外，有研究表明，从破裂血管中渗漏的Fg可激活星形胶质细胞和小胶质细胞，表明其参与SSCI。巴曲酶（BX）是从Bothrops moojeni蛇毒液提取的一种类凝血酶样丝氨酸蛋白酶。与凝血酶相比，BX只降解Fg的α链，生成的纤维蛋白单体交联形成纤维蛋白多聚体的能力较差，因此，可通过降低血中Fg而改善血液循环。BX已成功应用于各种缺血性疾病，如中风、深静脉血栓、心肌梗死、外周动脉血栓和突发性耳聋。但对于脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的作用尚无研究报道。鉴于缺血在SCI病理机制中的重要作用，本研究旨在探讨BX对SCI的保护作用及可能的临床应用。本研究由以下三部分实验组成：实验一：巴曲酶对大鼠脊髓损伤后血流动力学和凝血功能的影响本部分实验通过建立大鼠脊髓夹伤模型，研究不同剂量BX对大鼠SCI后血流动力学、凝血功能和损伤局部血流量的影响。于第三次给药后2h采用全自动凝血因子分析仪、全自动血粘度测定仪和激光多普勒血流测定仪，检测BX对大鼠血中Fg、凝血功能的作用及对损伤局部血流量的影响。结果显示BX可剂量依赖性的减少血中Fg含量，并降低血粘度；凝血功能结果表明，2BU/kg BX对凝血功能无影响，4BU/kg BX可显著性延长凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）。激光多普勒血流测定结果提示，与生理盐水对照组相比，2BU/kg BX可显著性增加损伤局部脊髓血流量，而4BU/kg BX但无显著效果。实验二：巴曲酶对大鼠脊髓损伤的神经保护作用本部分实验通过大鼠脊髓夹伤模型研究BX对SCI的保护作用。于SCI后7d采用NeuN和GFAP免疫组化染色，SCI后1、4d和7d通过BBB评分、RHI实验和足迹分析实验进行行为学观察，观察BX对SCI后大鼠神经功能的影响，结果显示，2BU/kg BX可显著性增加损伤旁区NeuN阳性细胞数量并缩小损伤空洞面积，同时促进大鼠SCI后运动功能恢复，而4BU/kg BX无显著效果。实验三：巴曲酶对大鼠脊髓损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞反应的作用本部分实验通过大鼠脊髓夹伤模型观察BX对星形胶质细胞和小胶质细胞反应的作用。于SCI后7d采用GFAP、Neurocan、Iba-1免疫组化染色，荧光强度分析结果显示，2BU/kg BX可显著性减轻脊髓损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞反应，而4BU/kg BX无显著效果。以上研究发现：BX可通过减少血中Fg含量降低血粘度；2BU/kg BX可改善损伤脊髓局部血流量，增加损伤旁区神经元存活，并促进大鼠SCI后行为功能恢复，还可减轻SCI后星形胶质细胞和小胶质细胞反应，从而可能参与减轻胶质瘢痕和炎症反应。而4BU/kg BX对损伤脊髓局部血流量、神经元存活、行为学恢复及星形胶质细胞和小胶质细胞反应均无显著效果，其相关机制有待进一步研究。SCI会破坏血脊髓屏障（blood spinal cord barrier），后者是触发SSCI的关键环节之一。BSCB的渗透性改变，会引起大量血液蛋白外渗而导致血管源性水肿，参与SSCI。已有研究表明，促进SCI后BSCB修复有助于减轻SSCI，并改善功能恢复。然而，参与SCI后BSCB改变的分子机制至今仍不甚清楚。SCI后，多种发育相关分子重新表达，参与SCI的病理改变。作为一种重要的模式发生信号，Sonic hedgehog/Gli1（Shh/Gli1）信号通路在胚胎发育中的作用已被广泛研究。在脊髓的发育中，Shh通过旁/自分泌的方式诱导神经管腹侧结构的形成。最近的研究发现，Hedgehog信号对于维持胚胎和成年血脑屏障（blood brain barrier）的完整性至关重要。SCI后，Shh/Gli1信号是否可被激活，并参与SSCI，至今尚未见报道。在本研究中，我们采用Shh/Gli1信号报告基因及Gli1基因敲除小鼠，研究了脊髓夹伤后Shh/Gli1信号的激活、BSCB的改变，以及运动功能的恢复，初步探讨了Shh/Gli1信号在SCI中的作用。本研究由以下三部分组成：实验一：脊髓损伤后Shh/Gli1信号的激活本部分实验采用Shh/Gli1信号报告基因Gli1lz小鼠，通过脊髓夹伤和假手术处理，于损伤后3d采用X-gal染色，观察Shh/Gli1信号在SCI后的激活情况。X-gal染色结果显示，SCI后3d脊髓损伤区呈深蓝色染色，而假手术小鼠脊髓呈X-gal染色阴性。提示Shh/Gli1信号可在SCI后激活。进一步观察了SCI后Shh/Gli1信号的来源及其反应细胞。于损伤后7d采用Shh/PDGFr-α、Shh/GFAP、LacZ/GFAP免疫组化染色，观察Shh/Gli1信号的来源及其反应细胞。双标结果显示，SCI后7d，绝大多数Shh阳性细胞为PDGFr-α阳性，并主要分布于GFAP阳性细胞构成的胶质瘢痕的内侧，提示脊髓损伤后损伤区中心的周细胞表达Shh。LacZ的免疫组织化学染色发现，LacZ阳性细胞主要分布在损伤区周围，绝大多数为GFAP阳性，损伤区远侧的星形胶质细胞未见LacZ阳性染色。提示SCI后，损伤区中心的周细胞可能表达并分泌Shh，后者激活了反应性星形胶质细胞中的Shh/Gli1信号。实验二：Gli1敲除对脊髓损伤后GFAP表达和血脊髓屏障的影响考虑到星形胶质细胞是Shh/Gli1信号的反应细胞，且星形胶质细胞是BSCB的重要组成部分。本部分实验采用野生型和Gli1lz/lz小鼠脊髓夹伤模型，研究Gli1敲除对SCI后GFAP表达和BSCB的影响。SCI后7d，采用免疫组织化学和实时定量RT-PCR法比较野生型和Gli1lz/lz小鼠SCI后损伤区周围GFAP的表达，结果发现两组小鼠脊髓损伤区周围的GFAP的mRNA表达无显著差异。提示Gli1敲除可能对SCI后GFAP的表达无显著影响。Gli1lz/lz小鼠脊髓损伤后14d，伊文斯兰染色可见损伤区淡蓝色染色，而野生型小鼠无明显伊文斯兰染色。取脊髓组织匀浆，分光光度计测量结果显示Gli1lz/lz小鼠脊髓中伊文斯兰的含量显著高于野生型小鼠。提示Gli1敲除可能参与SCI后BSCB通透性的改变。实验三：Gli1敲除对脊髓损伤后运动功能的影响考虑到BSCB改变参与SSCI，并影响运动功能恢复。本部分实验采用野生型和Gli1lz/lz小鼠脊髓夹伤模型，于术后1、3、5d和7d进行BMS评分，研究Gli1敲除对SCI后运动功能的影响。结果显示Gli1lz/lz小鼠SCI后的运动功能恢复显著差于同时间点的野生型小鼠。通过以上研究发现：Shh/Gli1信号在小鼠SCI后激活，可能参与SCI后BSCB渗透性的改变，并影响SCI后的运动功能恢复。