【摘 要】
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藏红花酸有极高的保健和药用价值。由于天然藏红花酸的产量极其有限,故此利用合成生物学手段进行藏红花酸的异源转化具有广泛的应用前景。杜氏盐藻是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻,生长速度快,培养方法简便,遗传转化稳定,特别是其胞内藏红花酸的前体分子——β-胡萝卜素含量可高达细胞干重10%,为目前所有已知微藻中含量最高。然而在杜氏盐藻的类胡萝卜素代谢途径中,缺失以β-胡萝卜素为底物催化生成藏红花酸的关键酶:玉
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藏红花酸有极高的保健和药用价值。由于天然藏红花酸的产量极其有限,故此利用合成生物学手段进行藏红花酸的异源转化具有广泛的应用前景。杜氏盐藻是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻,生长速度快,培养方法简便,遗传转化稳定,特别是其胞内藏红花酸的前体分子——β-胡萝卜素含量可高达细胞干重10%,为目前所有已知微藻中含量最高。然而在杜氏盐藻的类胡萝卜素代谢途径中,缺失以β-胡萝卜素为底物催化生成藏红花酸的关键酶:玉米黄素裂解酶（ZCD）。本研究拟通过高产β-胡萝卜素的杜氏盐藻,利用基因工程在杜氏盐藻中表达来自藏红花的ZCD外源基因（CSZCD）,以期通过合成生物学手段在杜氏盐藻中构建藏红花酸的合成途径,获得具有藏红花酸合成能力的转基因杜氏盐藻工程株。具体研究结果如下:1.利用改良后的培养基,通过光照强度、培养温度、各组份配比等优化,确立杜氏盐藻的最优生长曲线;2.基于pCAMBIA3301载体为骨架,成功构建杜氏盐藻的重组表达载体pCAMBI3301-CSZCD,并通过玻璃珠转化法将重组质粒导入盐藻细胞;3.通过草铵膦抗性平板筛选,利用PCR技术和基因测序技术对转化藻株进行分子水平检测,鉴定获得能够稳定遗传外源基因CSZCD的盐藻转化藻株,4.通过高效液相色谱比较分析野生型与转化藻株中藏红花酸含量变化,并利用LC-MS分析杜氏盐藻转化株藏红花酸的相关化合物,初步验证转CSZCD基因的杜氏盐藻能合成藏红花酸相关化合物。本研究成功构建杜氏盐藻的遗传表达载体,获得具有稳定表达外源CSZCD基因的杜氏盐藻转化株。通过HPLC和LC-MS分析后,发现CSZCD基因在杜氏盐藻中的成功表达能实现藏红花酸相关化合物的合成,为后续通过基因工程手段从杜氏盐藻中合成藏红花酸奠定技术基础。
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