论文部分内容阅读
发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）是一种新发现的布尼亚病毒,能够感染人类并引起发热伴血小板减少综合征（SFTS）,目前并无有效的治疗手段和药物,对其感染机制和致病机理的了解也并不完全。本研究中,我们使用THP-1细胞作为体外感染模型,研究宿主miRNA表达谱和细胞因子的表达水平变化,分析miRNA在SFTSV感染宿主细胞中的相关功能,欲从miRNA的角度探究SFTSV的致病机制以及宿主免疫机制,为预防和治疗疾病提供参考和理论依据。首先,我们建立了检测SFTS病毒滴度和中和抗体的ELISA方法。SFTSV能够感染多种细胞（如VERO,VERO-E6,L929等）并且不产生明显的细胞病变（Cytopathic effect,CPE）,通过肉眼观察CPE来判定病毒的增殖情况存在一定困难。因此我们建立了针对SFTSV核蛋白的间接ELISA检测方法,检测结果通过OD值进行标准化的客观判定,可以准确地对病毒进行定量,改进了实验终点判定方法。该ELISA方法通过检测病毒N蛋白的特异性抗体IgG,能够直接反映被检样品中的病毒含量,特异性及灵敏度较高;消除了判定过程中的人为主观因素,具有重要的应用价值。此外,我们使用低密度芯片（TLDA）检测了 THP-1细胞受到感染后0-48h内miRNA的表达水平,并从检测到的768种miRNA中找出60个miRNA的表达呈现有规律的变化趋势;经过筛选与验证,最终确定3个miRNA与芯片结果较为一致,分别为miR-199b、miR-450a和miR-182。随后我们对miR-199b和miR-450a进行了功能研究。我们分别检测了 THP-1在受到SFTSV感染、过表达miR-199b、miR-450a和抑制miR-199b、miR-450a后炎性因子的表达水平。结果显示,在SFTSV感染组中,共检测出10种因子的mRNA水平在感染后0-32h内呈现有规律的差异表达,分别为IL-6、IL-8、IL-10、IL-1ra、IL-1β、IFNβ、IFNγ、IP-10、MCP-1 和 TNF-α;而在蛋白水平只检测出 IL-1β、IL-8、TNF-α、IP-10、MCP-1和IL-1ra这6种细胞因子差异表达。在过表达/抑制miR-199b实验组中,共有8种细胞因子差异表达,为IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFNα、IFNβ、IP-10和TNF-α;过表达/抑制miR-450a实验组中则检测到IL-8、IL-10、TNF-α、IFNα、IFNβ和IP-10差异表达。在miRBase中我们筛选出miR-199b经验证的靶基因有IL1RL1、IRAK4、IRF9,这3个基因在Ⅰ型干扰素通路中均具有重要的调节作用。综合以上实验结果,我们推测SFTSV感染引起的细胞因子表达异常可能与miR-199b和miR-450a相关,miR-199b和miR-450a可能参与了调控宿主细胞免疫反应。综上所述,本研究通过分析宿主细胞感染SFTSV后不同时间内miRNA的表达谱,发现miR-199b、miR-450a和miR-182呈现有规律的差异表达;通过对miR-199b和miR-450a进行功能研究,我们初步推测SFTSV感染后宿主多种细胞因子表达水平的变化可能与宿主细胞miR-199b和miR-450a相关,这2个miRNA在宿主细胞抵抗SFTSV感染中具有重要的免疫调节作用,可能参与Ⅰ型干扰素抗病毒通路和炎性反应的调控,有助于我们了解SFTSV感染机制和宿主细胞的免疫调节机制。