研究背景:乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国严重的公共卫生问题,它可以从急性感染发展到慢性肝炎、肝硬化、甚至肝细胞癌。抗病毒治疗是慢性乙肝的最根本疗法,核苷酸类似物（NAs）是当前的最主要药物,但只能抑制HBV复制,无法彻底清除HBV,导致慢性乙肝患者停药后经常复发。HBV感染诱发肝炎的主要病理机制是机体免疫反应所致。机体不同强度的免疫应答与HBV的清除、肝炎的发生以及疾病预后等密切相关,其中HBV抗原特异性CD8+T细胞介导的细胞免疫应答反应尤为重要。该免疫应答由病毒感染细胞的HLA-A、B、C等HLA I类分子提呈HBV抗原肽给特异性CD8+T细胞而启动和控制。由于HLA I类分子的等位基因在人群呈高度多态性,不同HLA I类分子提呈的抗原肽也各不相同,因此不同患者所引起的HBV特异性T细胞免疫反应强度各不相同。明确各种不同HLA I类分子限制性的HBV抗原表位肽是分析患者个性化HBV特异性细胞免疫功能状态的关键,有利于监测HBV患者在疾病进程中尤其是停药复发前后外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量及反应活性,有利于NAs联合免疫治疗的方案制定和疗效观察等。研究目的:鉴定基因总频率大于50%的3种HLA-A（HLA-A0201、A1101、A2402）分子限制的HBV抗原T细胞表位肽,用于建立检测HBV患者外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量及反应活性的酶联免疫斑点分析（Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）方法,制备一种新型的、个性化HBV抗原特异性细胞毒性T细胞（CTL）ELISPOT试剂盒,为乙型肝炎的疾病诊断、治疗方案制定、临床疗效评估以及慢性转归预测等提供全新的实验室指标,促进精准医疗的施行。研究方法:（1）针对HBV四种蛋白（HBs Ag、HBc Ag、HBpol、HBx）,通过六种表位肽预测网站（SYFPEITHI、BIMAS、SVMHV、IEDB、EPIJEN、NETMHC）预测筛选基因频率大于1%的13种HLA-A（HLA-A0101、A0201、A0203、A0206、A0207、A0301、A1101、A1102、A2402、A2601、A3001、A3101、A3303）分子限制性HBV抗原优势表位肽;（2）从东南大学附属南京市第二医院检验科收集慢乙肝住院患者外周血,分离外周血单个核细胞（PBMC）,将3种HLA-A分子的预测肽分为三组（HLA-A0201:9种、A1101:8种、A2402:8种）,分别刺激培养40h后,通过IFN-γELISPOT方法筛选出对任何一组混合肽有特异性CTL反应的乙肝患者;（3）重新采集CTL阳性反应的慢乙肝患者新鲜外周血,用相同的方法鉴定每组混合肽中单种抗原肽的免疫原性;并且通过聚合酶链反应-直接测序分型技术（PCR-SBT）对慢乙肝患者进行高分辨率HLA-A等位基因分型;（4）组装成基于这三种HLA-A分子的HBV特异性ELISPOT检测试剂盒:利用健康人外周血进行初步试验,同时与其他两大公司的基础试剂盒对比;将HLA-A0201、A1101和A2402分子限制的HBV抗原表位肽混合为3组,根据乙肝患者HLA-A等位基因的不同和其所限制性的HBV抗原肽,检测其外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞数量及反应活性,个性化分析患者针对HBV的特异性细胞免疫功能状态。研究结果:（1）通过六种表位肽数据库的虚拟预测,根据每种预测方法的评分标准筛选出每种HLA-A分子限制的候选HBV抗原T细胞表位肽,每种HLA-A分子再从中筛选出虚拟亲和力最高的针对4种HBV蛋白的8-9种表位肽作为待鉴定表位肽;（2）通过IFN-γELISPOT方法从126例慢乙肝患者中筛选出14例对HBV混合肽呈CTL阳性反应的患者,再对单种待鉴定肽的免疫原性进行鉴定。结果获得21种具有免疫原性的抗原肽,其中11种未见报道。13种被HLA-A0201限制和提呈,16种被HLA-A1101限制和提呈,11种被HLA-A2402限制和提呈。（3）成功组装了HBV抗原特异性CTL ELISPOT试剂盒,对50例慢乙肝患者进行了检测,其中14例呈明显CTL阳性反应,36例对上述21种抗原肽无CTL反应。结论:明确21种被3种HLA-A分子限制的HBV抗原肽,成功组装具有个性化特点的HBV特异性CTL ELISPOT检测试剂盒。