脑卒中的发病常伴随高致死率和高致残率,是目前乃至未来几十年内全世界健康卫生事业所面临的巨大挑战之一。基于其发病机制将脑卒中主要分为两大类,出血性脑卒中(Hemorrhagic stroke,HS)与缺血脑性卒中(Ischemia stroke,IS),其中IS在脑卒中占比超过75%。IS脑梗死区域脑血流再通后,反而导致该区域脑组织损伤进一步加重,即IS后脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)。现阶段临床上对于CIRI的治疗主要依赖于溶栓疗法,也是现今为数不多的有效治疗手段,但碍于其狭窄的―治疗时间窗‖许多患者错过最佳救治时机,最终导致脑组织不可逆性损伤。因此,研究IS后CIRI发病机制,寻找更稳定、更高效的干预措施对于IS的救治极为重要。香豆素类化合物衍生于一组杂环化合物,它们在药理学研究中相当重要。这类化合物天然存在于草本植物中,且常被用于制备或合成某些特定的药物,在药物中体现出各种各样的生物活性。诸多此类化合物在实际应用过程中被发掘出具有对抗氧化损伤的能力,而在这些具有抗氧化能力的化合物中,双香豆素类衍生物由于其特殊的分子结构而备受关注,它们基于固定母核通过不同的取代基进而发挥出了多种多样的抗氧化生物活性。细胞存在内源性氧化与抗氧化程序,在生理条件下二者趋于平衡。当细胞受到损伤、刺激时,细胞内氧化抗氧化水平失衡,致使细胞处于氧化应激(Oxidative stress,OS)状态,胞内活性氧类(Reactive oxygen species,ROS)堆积并透支细胞内源性抗氧化因子,最终对细胞产生不可逆的损伤。而中枢神经系统对于OS损伤敏感,在CIRI损伤后整个中枢神经系统将处于一个显著的OS环境之中。故对抗OS维持中枢神经系统氧化还原平衡状态,将是逆转CIRI导致神经细胞损伤的关键措施。【目的】1.本实验室自主合成一系列新型双香豆素衍生物,我们从中初步筛选出具有神经保护潜力的化合物;2.初步筛选出化合物后,研究目标化合物基于CIRI在细胞水平与动物水平的神经保护效果;3.明确目标化合物对氧糖剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)神经元ROS释放、抗氧化酶mRNA转录、抗氧化指标的影响;4.揭示目标化合物对内源性抗氧化通路的影响以及其具体机制,并明确该化合物分子与抗氧化通路的具体作用模式;5.观察目标化合物对于神经元线粒体的影响,以及神经元线粒体处于OS状态下该化合物可以发挥出的保护性作用。【方法】1.通过显微操作分离胎鼠的大脑皮层组织,利用Neurobasal培养基与B27培养原代神经元,并用于后续试验研究;2.通过核磁共振氢谱等手段验证化合物纯度并选择多个该类化合物,对它们进行抗氧化能力筛选,初步筛选出具有抗氧化神经保护潜力的目标化合物,建立OGD模型以及小鼠大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,进一步验证目标化合物神经保护作用的可靠性;3.CCK-8试验确定化合物细胞稳定性区间以及细胞存活率范围;PI/Hoechst染色研究目标化合物对OGD损伤后神经元死亡的影响;q-PCR检测神经元抗氧化酶mRNA受到该化合物的影响;试剂盒检测各种抗氧化酶与MDA含量的改变;4.研究化合物在动物水平保护性效果,检测MCAO脑梗死体积、神经行为学评分、脑水肿等指标,检测HE、尼氏染色等病理学指标;5.Western blot、免疫组化、免疫荧光等手段研究目标化合物对内源性抗氧化通路的影响,检测化合物对核因子相关因子2(Nuclear factor E2 related factor,Nrf2)Nrf2/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)信号通路的影响,分子对接模拟研究化合物与抗氧化通路关键蛋白的具体作用方式;6.JC-1染色、ATP检测、透射电镜等研究OGD损伤神经元线粒体在目标化合物干预下的状态及功能变化。【结果】1.本研究前期合成了一系列以双香豆素为母核的新型双香豆素类衍生物,我们从这些衍生物中筛选出具有抗OS潜力的化合物,经验证化合物纯度99%以上,进而深入研究目标化合物对于CIRI的保护性效应及机制;2.本研究首先筛选出具有抗OS能力的化合物。结果提示6种备选化合物中,3号化合物(Compound 3,COM 3)显著提升了氧化损伤神经元中两种内源性抗氧化酶:超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的表达,提示COM 3具有显著的抗氧化能力;3.进一步探究COM 3对CIRI的保护性效果,并在细胞及动物水平进行研究。结果显示,在COM 3 10μg/ml浓度处理下对OGD损伤原代培养神经元保护性效果最佳,同时显著缓解了OGD后神经元坏死以及凋亡。在10 mg/kg浓度腹腔注射下对MCAO损伤C57BL/6小鼠的脑组织保护性效果最佳,显著减少了MCAO小鼠脑梗死体积并提高了MCAO小鼠神经行为学评分;4.在机制研究中,Western Blot结果提示Nrf2核转录增强并激活抗氧化通路,进而上调抗氧化酶表达进而减少ROS在神经元内堆积,调控神经元氧化还原代谢趋于生理水平,从而起到神经保护作用。分子对接结果显示COM 3通过3个氢键与2个π-π作用占据Nrf2与Keap1蛋白的功能性结合位点而影响了Keap1与Nrf2的结合能力;5.为进一步发掘COM 3的潜在神经保护机制,试验结果显示COM 3可降低OGD神经元线粒体膜电位、提高神经元ATP水平、改善神经元线粒体形态、缓解线粒体OS损伤。【结论】新型双香豆素类衍生物COM 3,可显著改善CIRI后神经系统OS状态,对抗CIRI并减少MCAO小鼠脑梗死体积,改善神经行为学表现,恢复OGD神经元损伤,改善线粒体功能。COM 3可与Nrf2/Keap1通路相互作用,进而增强了内源性抗氧化系统的活性。为自主合成新型化合物干预CIRI导致的神经系统病变的研究奠定理论基础,同时为双香豆素类衍生物作为治疗IS的新型药物的自主研发提供新思路。