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近年来,长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）对于人类健康的重要性越来越受到重视。目前人类获取LC-PUFA的主要来源是深海鱼油,然而鱼油面临资源短缺和环境污染的风险,因此需要寻找新的替代来源。海洋微藻能从头合成LC-PUFA,是海洋LC-PUFA的初级生产者。海洋微藻LC-PUFA合成代谢途径的研究对于开发LC-PUFA的替代来源具有重要的意义。长链酰基辅酶A合成酶（LACS）在脂肪酸代谢中起关键作用。游离脂肪酸必须在LACS催化作用下活化成酰基辅酶A,才能进入后续脂肪酸的代谢途径,如碳链延长、甘油三酯合成、糖脂合成、磷脂合成、β氧化等。研究LACS在产油微藻脂肪酸代谢中的功能有助于全面解析LC-PUFA的合成途径。本论文以富含LC-PUFA的海洋微藻-三角褐指藻为对象,采用分子生物学和生化等方法研究五个长链酰基辅酶A合成酶（ptACSL1-5）的生化特性。主要研究结果如下:（1）采用逆转录PCR扩增ptACSL1-4编码基因,分别构建ptACSL1-4与GFP的融合表达质粒,转化三角褐指藻,通过观察GFP荧光确定其亚细胞定位。结果表明:ptACSL1、ptACSL2和ptACSL3定位于质体,ptACSL4定位于细胞质膜和细胞质,而ptACSL5已知定位于过氧化物酶体。进一步通过GFP自组装方法确定了ptACSL1在质体中的具体定位:ptACSL1蛋白N端跨膜区位于叶绿体内质网（chloroplast ER）膜上,而C端位于胞浆。（2）通过体外酶活实验研究了ptACSL1-5蛋白的底物特异性。分别构建ptACSL1-5蛋白C末端融合6×His标签的表达质粒并转化到大肠杆菌进行异源表达,使用亲和层析方法分别纯化得到对应ptACSL重组蛋白,在体外酶反应体系中以不同游离脂肪酸为底物采用NADH消耗法测定重组蛋白的酶活。结果表明:以C18:1为底物时,五个ptACSL蛋白都检测到较高的酶活（175.50-330.38 nmol/min/mg）;分别以五种不同脂肪酸为底物时ptACSL1和ptACSL2都能检测到酶活;以C20:5为底物时,ptACSL1和ptACSL4的酶活相对其它底物高2个数量级,分别高达3135.05 nmol/min/mg和2388.8 nmol/min/mg。（3）采用Western blot方法研究了在缺氮培养和不同CO2浓度（空气、1%、4%、10%）培养条件下ptACSL1-5蛋白的表达模式。缺氮72 h内,ptACSL1、ptACSL3和ptACSL4蛋白表达持续上调,而ptACSL2蛋白表达下调。随着CO2浓度的提高,ptACSL1、ptACSL2和ptACSL4蛋白表达量降低;CO2浓度从空气提高至4%时,ptACSL3表达量明显增加,CO2浓度进一步增加至10%则抑制其表达。（4）采用CRISPR/Cas9技术分别构建ptACSL1-5基因敲除突变株。分别根据五个ptACSL基因序列各设计6个sgRNA,并构建相应CRISPR/Cas9质粒。以转化子基因组DNA为模板采用巢式PCR检测并对gRNA敲除位点区域进行测序。结果表明突变类型均为片段缺失,缺失片段大小为67-733bp,单基因突变率约为33-70%,每个ptACSL基因选取3-5个突变株用于后续分析。综上所述,本论文对三角褐指藻的五个ptACSL蛋白的亚细胞定位、底物特异性、表达模式进行了研究,并构建了ptACSL1-5基因敲除突变株,为后续阐明ptACSL1-5在脂肪酸代谢途径中的分子调控功能奠定了基础。