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RNA沉默是植物体内固有的一种抗病毒防卫反应,而大多数植物病毒编码的RNA沉默抑制子可以克服这种寄主的防卫反应。本研究利用转录后基因沉默原理,分别构建含沉默抑制子CMV 2b基因、PVY HC-Pro基因部分片断以及融合2b和HC-Pro基因部分片段反向重复的植物表达载体,通过在植物体内形成dsRNA沉默目标基因2b和HC-Pro,获得了单独抗CMV、单独抗PVY以及双抗CMV和PVY的云烟85转基因烟草植株,明确了dsRNA介导的转基因抗病毒基因工程策略的可行性。1. CMV 2b基因的克隆和序列分析从安徽亳州采集表现明显CMV症状的烟草样本, RT-PCR扩增CMV RNA2部分片段,克隆并测序。其中包含的2b基因全长336个核苷酸,编码111个氨基酸。序列比对表明,来源于安徽烟草的CMV 2b基因与来源于韩国的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高,达98.8 %。构建2b基因系统关系树,也表明来源于安徽烟草的CMV 2b基因与AF033667亲缘关系最近。2.反向重复植物表达载体的构建1)2b基因部分片断反向重复表达载体的构建以安徽CMV 2b为模板,分别扩增大小约为300 bp的正向片段2b （r）和反向片段2b （i）。先后将反向片段2b （i）和正向片段2b （r）分别插入载体pSK-In所含intron两侧,获得重组质粒pSK-2b （r）-In-2b （i）。再将含intron的正反向片段插入pBIN438,最终得到含2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b （r）-In-2b （i）。2)HC-Pro基因部分片段反向重复表达载体的构建（见陈伟论文）3)融合2b和HC-Pro基因部分片段反向重复表达载体的构建将HC-Pro基因部分序列反向重复片段插入质粒pBIN-2b （r）-In-2b （i）,最终获得同时含2b和HC-Pro基因反向重复片段的重组质粒pBIN-2b （r, i）-HC （r, i）。3.转基因阳性烟草植株的获得3种植物表达载体pBIN-2b （r）-In-2b （i）、pBIN-HC （r）-In-HC （i）和pBIN-2b （r, i）-HC （r, i）分别转化农杆菌EHA105,叶盘法转化烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85,经预培养、农杆菌浸润、分化培养和生根培养,最终获得3种卡那抗性再生植株。对抗性再生植株进行PCR检测,获得了转2b基因、HC-Pro基因以及融合2b和HC-Pro基因反向重复片段的T0代转基因阳性植株。4. T0代转基因烟草植株的抗病性鉴定转2b基因的烟草植株接种CMV,转HC-Pro基因的烟草植株接种PVY,转融合2b和HC-Pro基因的烟草植株接种CMV和PVY,通过生物学症状观察和间接ELISA检测,分别获得单独抗CMV、单独抗PVY以及双抗CMV和PVY的T0代转基因烟草植株。