乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居全世界女性肿瘤首位。约有30%的患者即便在疾病早期治疗，最终仍会复发、转移。在诊断时即发生转移的患者，常规的治疗通常最初能够有效的控制疾病的发展，但随着时间的发展，大多数患者最终会病情恶化。为了减少病死率，研发新的治疗策略，这就需要我们充分掌握乳腺癌细胞的分子生物学特点。研究发现肿瘤细胞中存在着一小部分干细胞样的细胞，这部分细胞具有自我更新和特定分化的能力，并在维持肿瘤生长、血管生成及促进肿瘤侵袭转移中起决定性作用，被命名为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)。到目前为止，已在乳腺癌、白血病、胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌和肝癌等恶性肿瘤中发现了肿瘤干细胞的存在。2003年Al-Hajj等首次在乳腺癌标本中分离出乳腺癌干细胞，发现几百个Lin-CD44+CD24-/lowESA+细胞在NOD/SCID小鼠中就可以形成肿瘤。乳腺癌干细胞的存在增强了乳腺癌的增生、侵袭和转移能力。同时，乳腺癌干细胞通常对常规化疗耐药，被认为是治疗失败的原因。因此，目前如何根除肿瘤干细胞成为学者们研究的热点。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为21~23个核苷酸的小分子非编码RNA，在多种生物学过程中起着重要的调节作用。miRNA可以通过与靶基因mRNA的特定位点碱基互补配对结合，抑制该蛋白的表达或诱导其mRNA的降解，从而参与基因的表达调控。miRNA可对肿瘤相关基因进行调节，在这个过程中，其可作为癌基因也可作为抑癌基因。在多种肿瘤组织中，观察到了miRNA的低表达。因此可以通过调控miRNA在肿瘤细胞，特别是肿瘤干细胞中的表达水平来寻求一种全新的治疗策略。miR-34家族包括miR-34a、miR-34b和miR-34c。研究表明抑癌基因p53可直接诱导miR-34表达,从而诱导细胞凋亡和细胞周期停滞。miR-34a在乳腺癌的增殖、侵袭和转移过程中都起着重要作用。新近研究发现，miR34a对前列腺癌、胰腺癌干细胞和胃癌干细胞均有一定的抑制作用。SIRT1是已经证实的miR-34a的靶基因之一。SIRT1是酵母沉默信息调节因子2（silent information regulator2, SIR2）的同源蛋白，是一种依赖NAD+组蛋白去乙酰化酶。SIRT1的去乙酰化酶作用不局限于组蛋白，还有一些非组蛋白，比如肿瘤抑制基因p53。SIRT1可通过调节靶基因的乙酰化状态来调控多种信号通路。SIRT1的功能涉及细胞的能量代谢、衰老和肿瘤等诸多方面。SIRT1是细胞凋亡过程中的抑制因子。SIRT1通过将p53第382位赖氨酸残基去乙酰化而抑制p53的活性，降低其对下游靶基因的激活作用，并由此减少由其诱导的细胞凋亡。本研究首先分选出MCF-7细胞系中CD44+/CD24-的乳腺癌干细胞群。应用qRT-PCR和Western blotting等技术检测乳腺癌干细胞群中miR-34a及其靶基因SIRT1的表达。其次，采用化学合成的miR-34a的mimics和inhibitors来调节miR-34a在MCF-7细胞系中的表达。同时，通过慢病毒载体来稳定且较长时间地调节miR-34a的表达。应用shRNA-SIRT1真核表达载体沉默SIRT1作为过表达miR-34a的阳性对照，研究miR-34a对MCF-7细胞增殖、侵袭转移和凋亡的影响，以及其对乳腺癌干细胞抑制作用的可能机制。将miR-34a过表达慢病毒载体感染的细胞株及稳定下调SIRT1的细胞株分别接种于裸鼠，在体内观察miR-34a对乳腺癌干细胞的抑制作用。第一部分MiR-34a及其靶基因SIRT1在乳腺癌干细胞中的表达目的：探讨miR-34a及其靶基因SIRT1在乳腺癌干细胞中的表达情况，为进一步研究其在乳腺癌干细胞中的功能奠定基础。方法：采用流式细胞仪和免疫磁珠法从无血清悬浮培养的乳腺癌细胞中分选CD44+/CD24-乳腺癌干细胞群和非干细胞群。采用荧光定量qRT-PCR检测miR-34a的表达。并通过qRT-PCR和Western blotting等技术检测SIRT1的表达情况。结果：流式细胞仪分选出的CD44+/CD24-细胞群约占细胞总数的9.90±3.54%，免疫磁珠分选出的分选出的CD44+/CD24-细胞约占细胞总数的7.20±4.06%，且均具有较高的成球率。在乳腺癌干细胞中miR-34a的表达降低，与非乳腺癌干细胞和未分选的MCF-7细胞之间比较具有显著性差异（p＜0.05)。SIRT1在乳腺癌干细胞中mRNA和蛋白水平的表达均明显高于非乳腺癌干细胞及未分选的MCF-7细胞（p＜0.01)结论：流式细胞仪和免疫磁珠两种分选方法均可以成功的分离出乳腺癌干细胞，两种方法各有优点。miR-34a在乳腺癌干细胞中低表达，而其靶基因SIRT1则呈现出较高的表达水平。miR-34a与SIRT1可能在乳腺癌干细胞干性的维持与自我更新中起着一定的作用第二部分MiR-34a靶向调控SIRT1基因的表达研究目的：在乳腺癌MCF-7细胞系中建立过表达或下调miR-34a的细胞模型，并构建稳定下调SIRT1的表达载体及细胞模型。方法：采用化学合成的miR-34a的mimics或inhibitors转染乳腺癌MCF-7细胞，qRT-PCR验证miR-34a的表达。慢病毒载体过表达miR-34a并筛选出稳定感染细胞株。设计SIRT1基因的shRNA，干扰乳腺癌MCF-7细胞中SIRT1的表达。采用qRT-PCR和Western blotting技术检测SIRT1mRNA和蛋白的表达。结果：转染miR-34a mimics的MCF-7细胞中miR-34a表达水平是mimics NC组及未转染Control组的20余倍，差异均具有统计学意义（p<0.01）。转染miR-34ainhibitors的MCF-7细胞中miR-34a的表达水平是inhibitors NC组的0.45±0.21倍，是未转染Control组的0.51±0.31倍，差异均具有统计学意义（p<0.05）。LV-miR-34a感染细胞可使miR-34a表达上调，与LV-NC组及未转染Control组比较均具有显著性差异（p<0.01）。ShRNA-SIRT1-3组和ShRNA-SIRT1-4组中SIRT1的mRNA与蛋白水平呈现显著性降低（p<0.05）。过表达miR-34a或者下调miR-34a都对SIRT1的mRNA水平无影响。miR-34a mimics可以有效抑制SIRT1蛋白的表达，与mimics NC组相比较具有显著性差异（p<0.01）。而miR-34a inhibitors组细胞SIRT1蛋白表达上调，与inhibitors NC组比较具有显著性差异（p<0.05）。结论：利用miR-34a模拟物和抑制物可以有效调控miR-34a在细胞中的表达，并有效改变靶基因SIRT1蛋白的表达水平。成功构建miR-34a慢病毒表达载体，有效调控miR-34a的表达。成功构建了pGPH1/GFP/Neo-shRNA-SIRT1表达载体，其中shRNA-SIRT1-3和shRNA-SIRT1-4均具有较好的干扰效果。第三部分MiR-34a对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用目的：探讨过表达miR-34a抑制裸鼠移植瘤及乳腺癌干细胞的机制方法：将过表达miR-34a和稳定下调SIRT1的细胞株分别接种于裸鼠乳腺部位，观察肿瘤生长情况，并采用免疫组织化学染色、qRT-PCR和western blotting技术分析相关蛋白的表达情况。结果：过表达miR-34a或下调SIRT1组移植瘤体积较小，生长缓慢。肿瘤组织中SIRT1和ALDH1表达减低。结论：过表达miR-34a能明显抑制裸鼠移植瘤的生长，并可能通过抑制SIRT1蛋白的表达而抑制乳腺癌干细胞。第四部分MiR-34a抑制乳腺癌干细胞的机制研究目的：研究miR-34a对MCF-7细胞增殖、侵袭转移和凋亡的影响，主要探讨其在乳腺癌干细胞中抑制作用的可能机制。方法：采用CCK8和克隆形成试验检测miR-34a水平变化对MCF-7细胞增殖的影响。Transwell迁移和侵袭试验检测miR-34a对MCF-7细胞侵袭转移的影响。流式细胞仪检测miR-34a对CD44+/CD24-乳腺癌干细胞比例的影响。乳腺球形成试验检验乳腺癌干细胞自我更新情况。Hochest33342和AV/PI双染检测乳腺癌MCF-7细胞的凋亡情况。Western blotting和免疫荧光细胞化学检测相关蛋白的表达。结果：过表达miR-34a可抑制MCF-7细胞的增殖、侵袭转移。下调miR-34a可促进MCF-细胞增殖、侵袭转移。miR-34a组和shRNA-SIRT1组乳腺癌干细胞比例下降。miR-34a组细胞所形成的乳腺球数量减少48.93±7.48%，shRNA-SIRT1组与shRNA-NC组比较，乳腺球数量减少57.78±6.59%。miR-34a组和shRNA-SIRT1组SIRT1、ALDH1、Nanog和BMI1蛋白的表达均低于相应对照组。Nanog蛋白免疫荧光检测发现miR-34a组和shRNA-SIRT1组荧光低表达。miR-34a组、miR-NC组、shRNA-SIRT1组及shRNA-NC组早期凋亡比例分别9.24±2.34%、1.32±1.73%、5.04±1.69%及2.22±2.06%。经统计分析表明，miR-34a与miR-NC组、shRNA-SIRT1与shRNA-NC组之间比较差异均具有统计学意义（p<0.05）miR-34a可促进MCF-7细胞凋亡。结论：MiR-34a可影响MCF-7细胞的增殖、侵袭转移能力。miR-34a可通过下调SIRT1而抑制乳腺癌干细胞的自我更新，其机制可能与Nanog蛋白表达下调有关。同时，miR-34a抑制乳腺癌干细胞至少部分是通过促进细胞凋亡而起作用。