链霉菌(Streptomyces)是活性产物的重要来源,其次级代谢产物应用广泛,可作为抗真菌药物、抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗高血压药、免疫抑制剂以及抗生素等。近年来从链霉菌发现新化合物的几率不断下降。但是基因组学研究结果显示链霉菌含有编码20个或更多潜在次级代谢物的基因,其中仅一部分在发酵过程中表达,说明链霉菌含有大量沉默基因,在新化合物发掘和新药研发方面仍有巨大潜力。本文期望通过CRISPR-Cas9技术靶向链霉菌rpsL基因引入K88E和P91S突变,改变核糖体稳定性,激发链霉菌自身次级代谢物合成潜能,即通过核糖体工程打开链霉菌次级代谢产物的合成途径。在模式菌株天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor 1147中K88E和P91S突变是激活效果较为明显的两种突变。CRISPR-Cas9技术在链霉菌中的应用是相对新颖的课题,最早的见刊文献在2014年年末。建立高效、普遍适用的基因组编辑系统对于后续唤醒沉默基因及优化菌株都具有极其重要的意义。本文首先针对链霉菌建立了一套CRISPR-Cas9系统,人工合成了 pCas9-1质粒,对11株海绵共附生链霉菌进行遗传操作。测试了质粒含有的热敏元件pSG5 rep、筛选标记阿布拉霉素抗性基因(acc)和硫链丝菌素抗性基因(trs),结果显示均能正常工作,并对各培养、筛选、质粒清除等条件进行了优化。利用该质粒定点突变链霉菌rpsL基因没有获得阳性结果。然后由pCas9-1质粒衍生出两种不同的质粒,分别命名为pCas9-2和pCas9-3。这三种质粒含有相同的sgRNA(用于靶向同一位点)和相同的同源重组(HR)模板,区别在于sgRNA和Cas9元件的启动子不同。利用这两种质粒再次对海绵共附生链霉菌开展操作,依然没有阳性结果。之后针对陆生链霉菌S.coelicolorAS4.242操作,pCas9-2质粒成功实现了定点突变,阳性率在50%以上,且多次重复显示该系统能稳定工作。在海绵共附生链霉菌中,三种质粒均无法成功实现定点突变,我们怀疑CRISPR-Cas9系统在目标宿主中工作异常,尤其是sgRNA和Cas9元件。即使在陆生链霉菌S.coelicolor AS4.242中,也只有pCas9-2能成功编辑。我们通过半定量RT-PCR方法比较陆生链霉菌S.coelicolor AS4.242转化三种质粒后的sgRNA和Cas9的表达水平,结果显示pCas9-2的sgRNA和Cas9表达量介于两者之间,且sgRNA表达量高于Cas9。因此推测在海绵共附生链霉菌的基因组编辑操作中应当仔细调配sgRNA和Cas9的表达量,且合适的sgRNA和Cas9的摩尔比约为13:1。另外Cas9表达量不宜太高,否则很可能会伤害到宿主。这些推测需要引入Real-time RT-PCR等更精确的定量方法,对多种宿主开展更多实验验证。论文最后对rpsL K88E和P91S突变的S.coelicolor AS4.242突变株进行了初步的活性检测。结果显示,突变后的菌株对链霉素耐受性提高:从<2 μg/mL上升至70-80 μg/mL,表明对S.coelicolor AS4.242的核糖体工程操作成功。但目前还没有检出突变株的抑菌活性,可能实验比较初步,发酵和萃取等步骤没有优化,设计更精密的实验后才能判断是否有次级代谢基因簇因定点突变而被激活。