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组蛋白特异性赖氨酸去甲基化酶1(Histone Lysine Specific Demethylase 1,简称LSD1)是由施洋教授课题组于2004年发现的首个具有黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin Adenine Dinucleotide,简称FAD)依赖的去甲基化酶。Wnt3a是一种分泌性蛋白,是由细胞分泌后可与细胞膜上的Wnt配体结合并激活Wnt信号通路的重要细胞因子。本论文通过分析胃癌组织病理切片中LSD1与Wnt3a的相关性,研究LSD1对Wnt经典信号通路的影响。1)胃癌组织病理切片中LSD1与Wnt3a表达水平的相关性研究已有文献报道,在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤等多种恶性肿瘤细胞中LSD1呈高表达状态。本课题组在前期的研究中发现,LSD1在胃癌细胞HGC-27和MGC-803中的表达量远远高于正常胃粘膜上皮细胞GES-1。另外,前期探索Wnt经典通路时发现,在MGC-803细胞中,改变LSD1的表达量能够通过调控Wnt通路关键蛋白Wnt3a的胞外分泌量而影响Wnt经典通路。因此,本课题进一步探索在胃癌病人癌组织中LSD1与Wnt3a表达量的相关性。首先选取收集到的94例胃癌病人的癌变组织和癌旁组织,并将其制作成病理组织切片,然后分别利用LSD1和Wnt3a的特异性抗体进行LSD1和Wnt3a的免疫组化染色,检测LSD1和Wnt3a在癌变组织和癌旁组织中的表达量,最后通过Spearman检验对二者进行相关性分析。结果显示,在胃癌病人组织中,LSD1表达量与Wnt3a表达量呈显著正相关。2)胃癌细胞中LSD1影响Wnt3a分泌的相关机制研究前面章节的研究发现在胃癌病人组织中LSD1和Wnt3a的表达呈现显著正相关,在此基础上,本章节将进一步在胃癌细胞和胃粘膜上皮细胞中研究LSD1与Wnt3a之间的相互调控机制。首先利用转染试剂脂质体3000将构建好的低表达质粒pLVX-shRNA-LSD1转染入胃癌细胞MGC-803、HGC-27、SGC-7901和胃粘膜上皮细胞GES-1中,然后利用Elisa实验检测细胞培养液中Wnt3a的蛋白表达量,结果显示,在胃癌细胞HGC-27、MGC-803和SGC-7901中,下调LSD1的表达量后Wnt3a的胞外分泌量均下调,而在胃粘膜上皮细胞GES-1中LSD1的表达下调后Wnt3a的胞外分泌量不发生明显变化。与此同时,提取细胞的RNA进行反转录后,利用qPCR实验检测PORCN蛋白的mRNA表达水平,结果显示,在胃癌细胞HGC-27,MGC-803和SGC-7901中,下调LSD1的表达量后PORCN蛋白mRNA的表达受到抑制,而在胃粘膜上皮细胞GES-1中下调LSD1的表达后,PORCN蛋白mRNA的表达不发生明显变化。说明在胃癌细胞中LSD1正向调控PORCN的转录从而影响Wnt3a的分泌。3)LSD1通过Wnt通路影响胃癌细胞的侵袭和转移本课题组的前期研究发现,在胃癌细胞中,LSD1表达量上调后能够促进细胞的侵袭和迁移,同时能够促进细胞的EMT过程.。文献调研发现,Wnt信号通路能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移和分化。本章节进一步研究LSD1对胃癌细胞侵袭、迁移能力和EMT过程的调节是否是部分依赖于Wnt信号通路。利用慢病毒包装的LSD1过表达载体感染MGC-803和SGC-7901细胞系,使该细胞系中LSD1的表达量升高,在确认LSD1的过表达效果后,在过表达细胞中加入PORCN抑制剂WntC59,利用划痕实验和Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力的变化,结果发现:在两株细胞中,LSD1表达量的上调能够促进该细胞的迁移和侵袭能力,且在上调LSD1表达量之后加入WntC59,这种促进作用将受到一定程度的抑制;通过Western Blot实验检测EMT标志蛋白E-Cadherin和N-Cadherin的表达量,结果显示在MGC-803细胞和SGC-7901细胞中,LSD1的表达量上调后,E-cadherin的表达显著降低,N-cadherin的表达明显升高,而当上调LSD1表达量的同时加入Wnt C59,E-cadherin的表达量降低的并不明显,N-cadherin的表达量升高的也不明显。因此我们认为LSD1对胃癌细胞的迁移,侵袭和EMT过程的影响很可能是通过Wnt信号通路实现的。