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目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全世界三大恶性肿瘤之一,是涉及遗传易感,环境暴露和不良生活方式等危险因素的多因素疾病。研究表明,肠道菌群失调可通过损坏肠道粘膜屏障、激发慢性炎症反应、分泌促肿瘤毒性代谢物和抑制抗肿瘤的细胞免疫反应等多种途径来促进结直肠癌的进展,并影响CRC侵袭、迁移、放化疗疗效及预后。分子钟节律紊乱通过调控原癌基因和抑癌基因的表达扰乱细胞周期、诱导炎症反应等多种途径参与结直肠癌的发生、发展。同时,肠道菌群的节律性震荡及微生物代谢物调节失衡也可对宿主昼夜节律产生效应;所以,我们认为肠道微生物通过调节宿主昼夜节律对结直肠癌的发生、发展具有关键的调节作用;但其具体调节机制还有待研究。本次研究探索大肠杆菌对分子节律基因隐花色素2（Cryptochrome 2,CRY2）表达的影响,大肠杆菌及其代谢物通过分子钟蛋白CRY2对结直肠癌细胞增殖和凋亡的调节以及其诱导抗化疗效应的调节作用。研究工作将有助于阐明大肠杆菌与宿主昼夜节律之间的互作机制,为肠道微生态联合昼夜节律平衡治疗结直肠癌提供理论基础。方法:（1）利用脂质体转染技术构建节律钟基因CRY2过表达结直肠癌细胞株,采用Hoechst33342和碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）双染的方法,检测节律钟基因CRY2过表达对结直肠癌HCT-116和RKO细胞凋亡与坏死的影响;验证昼夜节律对结直肠癌细胞活性的影响。（2）大肠杆菌及其代谢物与结直肠癌细胞共培养,检测结直肠癌细胞凋亡与坏死的变化;通过MTS法检测大肠杆菌及代谢物对结直肠癌细胞增殖活性的影响;Western bolt法检测大肠杆菌及代谢物干预后结直肠癌细胞中节律钟蛋白CRY2、自噬蛋白Beclin-1和促凋亡相关蛋白Caspase3、PARP表达量的变化;验证大肠杆菌及其代谢物通过节律钟基因CRY2引起结直肠癌细胞增殖活性的影响。（3）利用CRY蛋白稳定剂KL001恢复结直肠癌细胞节律钟负反馈调节环,检测大肠杆菌及其代谢物引起结直肠癌细胞凋亡、坏死与增殖的变化;Western bolt法检测小分子化合物KL001干预后结直肠癌细胞中节律钟蛋白CRY2、自噬蛋白Beclin-1和促凋亡相关蛋白Caspase3、PARP表达含量的变化;验证小分子化合物KL001修复节律钟蛋白CRY2对大肠杆菌及其代谢物引起结直肠癌细胞增殖活性的影响。（4）药物KL001、大肠杆菌及其代谢物共同处理结直肠癌细胞,MTS法检测化疗药物奥沙利铂和5-氟尿嘧啶对结直肠癌细胞化疗效果,验证肠道微生物引起昼夜节律紊乱对化疗药物杀伤结直肠癌细胞效果影响。结果:（1）通过q RT-PCR和Western bolt验证节律钟基因CRY2过表达结直肠癌HCT-116和RKO细胞株构建成功;与空白及阴性对照组相比,CRY2基因过表达后,结直肠癌细胞株细胞凋亡和坏死明显增高。（2）大肠杆菌及其代谢物明显抑制了结直肠癌细胞凋亡和坏死;MTS结果表明,大肠杆菌及其代谢物处理结直肠癌细胞后细胞增殖活性均升高,HCT-116细胞增殖活性在第5、7天出现显著升高（P<0.01、P<0.05）,RKO细胞增殖活性则是在第1、3、4天出现显著升高（P<0.001）。大肠杆菌及其代谢物干预能显著下调结直肠癌细胞节律钟CRY2蛋白表达（HCT-116:P<0.05;RKO:P<0.001）;细胞凋亡与自噬蛋白检测结果表明,大肠杆菌及其代谢物显著下调促凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的表达水平,而自噬蛋白Beclin-1表达水平被上调。（3）小分子化合物KL001稳定节律钟CRY2蛋白恢复结直肠癌细胞节律钟负反馈调节机制后,显著降低了结直肠癌HCT-116和RKO细胞的增殖活性,而且这种抑制程度随着药物浓度的升高而增加（KL001-5u M P<0.01、KL001-25u M P<0.001）;小分子化合物KL001稳定节律钟CRY2蛋白对大肠杆菌及其代谢物引起的结直肠癌细胞增殖具有抑制作用;细胞凋亡与自噬蛋白检测结果表明,小分子化合物KL001显著上调促凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的表达水平,而自噬蛋白Beclin-1表达水平被下调。（4）大肠杆菌及其代谢物大幅减弱了化疗药物奥沙利铂和5-氟尿嘧啶对结直肠癌细胞的化疗效果;小分子化合物KL001通过稳定CRY2蛋白大幅增强了化疗药物对结直肠癌细胞的化疗效果;小分子化合物KL001稳定CRY2蛋白对大肠杆菌及其代谢物引起的化疗抗性有一定的修复作用。结论:大肠杆菌及其代谢物通过抑制分子钟CRY2蛋白表达降低结直肠癌HCT-116和RKO细胞的凋亡与坏死,促进结直肠癌细胞增殖;大肠杆菌及其代谢物调节分子钟CRY2蛋白引起了结直肠癌细胞的抗化疗效应;修复节律钟CRY2蛋白对大肠杆菌及其代谢物引起结直肠癌细胞增殖活性和化疗抗性具有抑制作用。这项研究为肠道微生态结合昼夜节律平衡治疗结直肠癌提供了理论基础。